反义RNA和反义硫代寡核苷酸抗HBV转基因小鼠病毒疗效的比较

目的 比较人工合成的反义硫代寡核苷酸 (asODN )和反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac)在乙型肝炎(HBV)病毒转基因小鼠体内的抗病毒作用。 方法 设计合成针对HBV -pre -c/c基因的反义硫代寡核苷酸 5‘ -CAT GCCCCAAAGCCAC -3’。构建HBV -c区反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac) ,并以半乳糖 -多聚赖氨酸 (Gal15 -PLL)作肝靶向载体。将 2 0只HBV转基因小鼠分为反义寡核苷酸、反义RNA真核质粒表达、生理盐水组。靶向反义硫代寡核苷酸以每只体重 15 0ug剂量 ,反义RNA真核质粒每只 10 0ug剂量 ,尾静脉注射给药 ,对照组用同样体积生理盐水同样方法给药。 结果 注射asODN和PCEP4-aC后 7d血清HBsAg已有所下降 (P <0 .0 5 ) ;14d时显著下降 (P <0 .0 1) ,且血清HBV -DNA转阴率分别为 66.7% ( 4 /6)和 62 .5 % ( 5 /8) ,而生理盐水组无明显变化。 结论 反义硫代寡核苷酸和反义RNA真核表达质粒均能在乙肝转基因小鼠体内抑制HBV复制和表达 ,且两者在抑制作用上无明显差异性。

脂质体介导的c-myc反义硫代寡核苷酸诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的 探讨c myc反义硫代寡核苷酸 (antisensephosphorothioateoligodeoxynucleotide ,APSODN)对胃癌SGC 790 1细胞凋亡的影响。方法 人工合成c mycAPSODN ,通过脂质体转染法处理人胃癌细胞系SGC 790 1后 ,于不同时间收集细胞 ,采用Northernblot、Westernblot检测c myc基因mRNA及蛋白表达 ,采用TUNEL方法检测凋亡指数 ,以流式细胞仪检测细胞周期。结果 TUNEL显示c mycAPSODN可诱导胃癌SGC 790 1细胞凋亡 ,并与APSODN的浓度和处理时间有关。流式细胞仪检测显示细胞阻滞于G0 /G1期。结论 c mycAP SODN可诱导胃癌细胞凋亡。

bFGF反义硫代寡核苷酸增强人喉鳞癌Hep2细胞的化疗敏感性

目的:研究bFGF反义硫代寡核苷酸增强人喉鳞癌Hep2细胞对多柔比星、氟脲嘧啶及顺铂的敏感性。方法:设计、合成bFGF反义脱氧寡核苷酸(AS),用聚乙烯亚胺(jetPEI)介导bFGF反义脱氧寡核苷酸转染入Hep2细胞;半定量RT- PCR测定bFGF反义硫代寡核苷酸转染后细胞中bFGF mRNA水平;免疫细胞化学法检测Hep2细胞转染前后bEGF的表达水平;FACS分析bFGF反义硫代寡核苷酸诱导细胞的凋亡;MTT法检测bEGF反义硫代寡核苷酸及其与化疗药物联合处理后的细胞增殖。结果:bFGF反义硫代寡核苷酸呈剂量与时间依赖抑制Hep2细胞增殖,最高抑制率为25.5%;被转染细胞bFGF mRNA和蛋白的表达分别降低52.0%和41.1%,细胞凋亡率为20.5%;bFGF反义硫代寡核苷酸协同多柔比星、氟脲嘧啶及顺铂作用Hep2,使3种药物的IC_(50)分别降低75.5%、83.5%及65.4%。结论:bFGF反义硫代寡核苷酸协同化疗药物增强Hep2细胞对化疗药物敏感性,将为人喉鳞癌的生物和化学药物治疗增添新途径。

反义硫代寡核苷酸对人膀胱癌细胞端粒酶活性的影响

目的 探讨端粒酶抑制剂对膀胱癌 BIU- 87细胞端粒酶活性的影响。方法 用TRAP- EL ASA法检测端粒酶抑制剂反义硫代寡核苷酸 (as ONS)对膀胱癌 BIU- 87细胞及其细胞裂解物端粒酶活性的影响。结果 as ONS能够部分抑制人膀胱癌 BIU- 87细胞端粒酶的活性 ,呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性 ;as ONS与细胞裂解物直接作用组同作用细胞组相比 ,端粒酶活性下降的更为明显。结论 as

反义硫代寡核苷酸对小鼠柯萨奇病毒B_3性心肌炎影响的研究

目的 :观察AODN对小鼠病毒性心肌炎的影响。方法 :选取4～6周龄雄性Balb/C鼠(体重18～20g)48只,随机分为6组,8只/组,其中正常对照和病毒对照各1组,4个实验组。正常对照组小鼠腹腔内注射0.1mlRPMI1640,其它5组小鼠腹腔内接种0.1mlCVB3(200TCID50),半小时后4个实验组小鼠腹腔内注射0.2ml不同剂量的AODN ,正常对照组和病毒对照组分别注射0.2mlAODN媒体溶液。7天后测定血清LDH活性 ,并且进行心肌组织病理学检查。结果 :随注射AODN剂量增加,血清LDH活性逐渐降低 ;心肌细胞变性、坏死及间质炎性细胞浸润程度逐渐减轻 ;心肌炎发病率也逐渐降低。结论:AODN可保护小鼠心肌组织抵抗CVB3

硫代反义寡核苷酸及脂质体对培养细胞的毒性作用

目的 评价硫代反义寡核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotide ,AS ODN)及脂质体对肾小管上皮细胞的毒性作用。方法 针对大鼠骨调素 (osteopontin ,OPN)的cDNA序列设计合成与OPNcDNA序列互补的AS ODN ,其所有碱基均经硫代修饰 ;用不同浓度的游离AS ODN或阳离子脂质体 (DOTAP)处理大鼠肾小管上皮细胞株 (NRK5 2E)不同时间 ,采用噻唑蓝 (MTT)比色法测定细胞的存活率。结果 硫代AS ODN在 0～ 4 0 μmol/L浓度范围内或DOTAP在 0～ 10 0 μg/ml浓度范围内处理的NRK5 2E细胞存活情况良好 ;浓度 4 0 μmol/L的硫代AS ODN或浓度 10 0 μg/ml的DOTAP对NRK5 2E细胞的毒性作用较小 ,72h内无时间依赖性 ;浓度 2 0 0 μg/ml的DOTAP对细胞的毒性具有明显的时间依赖性。结论 正常使用浓度的DOTAP或硫代修饰的AS ODN对大鼠肾小管上皮细胞株均无明显毒性作用 ,建议在转染实验中 ,AS ODN ,DOTAP浓度分别不超过 4 0 μmol/L ,10 0 μg/ml,处理细胞时间小于 72h。

低pH毛细管区带电泳法分离寡核苷酸和硫代反义寡核苷酸

在低pH条件下采用毛细管区带电泳法对寡核苷酸（PO-ODNs）及具有药用价值的硫代反义寡核苷酸（PS-ODNs）药物“癌泰得”系列样品（18～20mers）进行分离，并系统考察优化了缓冲溶液的pH、缓冲溶液的种类及浓度、添加剂的种类及浓度、电压、温度等因素对样品单碱基分离的影响。其中缓冲溶液的pH对分离起决定性的作用，而添加剂尿素的加入显著提高了PS-ODNs样品的分离度。结果表明，采用末涂层弹性石英毛细管（50μm，总长49．0cm，有效长度40．7cm），以50mmol／L磷酸二氢钠-磷酸（pH2．24）-7 mol／L尿素为缓冲溶液，压力进样（2kPa×10s），负极进样，正极检测，在分离电压-20kV、柱温25℃、检测波长260nm条件下，可实现寡核岢酸及硫代反义寡核苷酸混合样品的单碱基分离。PO—ODNs的18～19mers及19～20mers样品的平均分离度分别为4．68，3．20；PS—ODNs的18～19mers及19～20mers样品的平均分离度分别为1．23及0．81．该法操作简单，重现性好，可为反义寡核苷酸药物的分析提供借鉴．

抑制TIMP-1的硫代反义寡核苷酸在肝纤维化大鼠体内生物学分布及药代动力学研究

目的 研究抑制TIMP 1的硫代反义寡核苷酸 (S asON )在肝纤维化大鼠体内的生物学分布及药代动力学 ,为其在临床上应用提供理论依据。方法 合成互补于TIMP 1基因的反义寡核苷酸并加以硫代磷酸化修饰 ;用γ 3 2p ATP标记 2 0聚S asON ,给实验大鼠尾静脉一次性注射 ,每 2 4h收集尿液和粪便 ;分别在 12个时间点上放血杀死实验大鼠 ,取各器官组织匀浆 ,用液体闪烁计数测定cpm值。结果 S asON广泛分布于全身各器官 ,以肝、肾聚积浓度最高 ,其药物能在体内维持 72h以上。血浆药物清除曲线符合二室模型。单位时间内机体清除药物的能力即血浆清除率为0 .0 7ml/h ,尿液为主要排除途径 ,2 4h排出 2 8.4% ,72h排出 44 .8% ,粪便排出量较少。结论 抑制TIMP 1的S asON在实验大鼠体内以肝、肾为主的广泛组织生物学分布和较长的清除半衰期 ,使其成药及临床用药变为可能 ,从而为研制新一代抗肝纤维化基因治疗药物奠定了实验基础。肝脏作为反义治疗的靶器官有着重要的现实意义。

全硫代反义寡核苷酸抑制人膀胱癌Ej细胞活性的实验研究

目的研究全硫代反义寡核苷酸(PS-ASODN)对人膀胱癌细胞Ej端粒酶活性及细胞生长的影响,探讨PS-ASODN在膀胱癌治疗中的价值,为临床治疗膀胱癌提供理论依据。方法将PS-ASODN转染作用于人膀胱癌细胞Ej中,分别采用MTT法、流式细胞术、酶联免疫吸附(ELISA)法检测不同浓度PS-ASODN对人膀胱癌细胞Ej的细胞增殖、细胞凋亡和端粒酶活性的作用。结果PS-ASODN作用于人膀胱癌细胞Ej后能显著抑制人膀胱癌细胞Ej的端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖,促进细胞凋亡,而且呈现时间特异性和剂量依赖性,与SODN转染组及空白对照组进行比较,差异显著(P<0.05或0.01)。结论PS-ASODN能抑制人膀胱癌细胞Ej的生长,降低其端粒酶活性并诱导细胞凋亡;抑制端粒酶活性可能成为膀胱癌基因治疗的新靶点。

BCL-2硫代反义寡核苷酸增强结肠癌细胞对顺铂的敏感性

目的 了解BCL-2(死亡抑制基因)硫代反义寡核苷酸增强结肠癌细胞对化疗药物的敏感性。方法 应用BCL-2硫代反义寡核苷酸(BCL-2 SON)和顺铂(cis-platinum)共同处理结肠癌细胞系SW620,通过免疫组化法观察其BCL-2蛋白表达的变化,并通过TUNEL染色和流式细胞仪检测细胞凋亡指数。结果 BCL-2 SON处理过的SW620细胞呈BCL-2免疫组化染色阴性,而对照组则为阳性。同时应用BCL-2 SON和10ug/ml顺铂共同处理的SW620细胞凋亡指数为64.7±8.4％,显著高于单纯顺铂处理组的23.6±6.3％(n=5,P<0.01)以及单纯BCL-2SON处理组的27.5±5.1(n=5,P<0.01)。而未经处理的对照组SW620细胞凋亡指数则为8.5±1.2％,显著低于后两组(n=5,P<0.05)。结论BCL-2SON可通过抑制结肠癌细胞BCL-2蛋白的表达,从而增强其对化疗药物的敏感性。

硫代反义寡核苷酸药物癌泰得纯化工艺的建立

目的建立硫代反义寡核苷酸药物癌泰得的大规模纯化方法。方法利用DMT的疏水性,在SOURCE15Q为填料的离子柱上预先用高盐缓冲液洗脱不带DMT基团的合成失败序列,然后直接在柱上用0.4%TFA切割,脱DMT保护后,使用盐浓度梯度分离硫代不完全片断和少量的(n-x)片断,从而获得纯品。结果以290nm为检测波长,流速为382cm·h-1,载量为12mg·g-1填料的条件下,平均产品收率为83.40%,质量平衡回收率为98.20%,产品终纯度可达98.23%。结论建立的方法能够有效纯化硫代反义寡核苷酸药物癌泰得,并可进行大规模纯化。

硫代反义脱氧寡核苷酸对脑胶质瘤SWO-38细胞的作用

目的 研究α1,4半乳糖糖基转移酶 (α1,4GalT)基因硫代反义核酸对脑胶质瘤细胞系SWO -3 8细胞的增值与凋亡的影响及其与Bcl -2和Bax表达的关系。方法 采用脂质体介导的基因转染方法将人工合成α1,4GalT基因反义核酸转入SWO -3 8细胞中。应用RT -PCR检测对α1,4GalTmRNA表达的影响 ,应用克隆形成实验检测对细胞增殖的作用 ,应用流式细胞术 (FCM)和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的发生 ,应用FCM检测Bax和Bcl -2表达的变化。结果 反义核酸转染后 ,经RT -PCR检测证实α1,4GalTmRNA基因的表达下降 ;克隆形成试验显示细胞生长明显受到抑制 (P <0 .0 1) ;FCM检测表明 ,导入α1,4GalT基因反义核酸的SWO -3 8细胞的凋亡明显增加 (P <0 .0 1) ,Bcl -2蛋白表达显著下降 (P <0 .0 1) ,而Bax蛋白表达显著提高 (P <0 .0 1)。结论 α1,4GalT基因硫代反义核酸可诱导脑胶质瘤细胞系SWO -3 8细胞凋亡 。

硫代反义寡核苷酸质量控制方法的研究进展

综述了高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、质谱(MS)和核磁共振(NMR)在硫代反义寡核苷酸质量控制中的应用。硫代修饰的反义寡核苷酸可以抑制基因的表达,在病毒感染和癌症治疗方面有着重要用途。药物要用于临床,必须对活性成分和生产相关的杂质进行鉴别、检查。对于硫代寡核苷酸,由于其结构特殊,必须综合运用包括HPLC ,CE ,MS和NMR在内的多种分析手段控制其质量。HPLC和CE技术用于对杂质和活性成分进行定性、定量分析;NMR可以精确地确定硫代产物的含量;MS则能够在测定硫代寡核苷酸分子量的同时确认其序列的正确性。

毛细管凝胶电泳法测定硫代寡核苷酸药物癌泰得的含量

癌泰得为20碱基的抑制端粒酶催化亚基hTERT的硫代反义寡核苷酸,体内、体外抗肿瘤活性评价显示其有较好的抗肿瘤活性。采用固相合成仪分别制备了癌泰得及与其碱基百分组成基本相同的硫代寡核苷酸内标,并使用制备型阴离子交换色谱和反相高效液相色谱进行纯化。采用毛细管凝胶电泳仪和单链DNA分离试剂盒测定了癌泰得的含量。所用毛细管规格为内径100μm,总长31cm,有效长度20cm;电动进样,进样电压-10kV,进样时间1s;分离电压-12 4kV;柱体温度40℃;样品储存温度为30℃;缓冲溶液为pH8 5的Tris 硼酸盐 7mol/L尿素缓冲液;紫外检测,波长为254nm。结果表明,在12 5～800mg/L时呈现良好的线性关系(r=0 99997);最低检测限为0 220mg/L;日内、日间的相对标准偏差(RSD)分别为0 449%～1 89%和1 01%～1 48%;低、中、高3种浓度的平均回收率为96 95%,RSD为6.88%。说明毛细管凝胶电泳内标法用于反义硫代寡核苷酸的含量测定结果准确、可靠。

反义硫代脱氧寡核苷酸体外抑制CVB持续感染的研究

目的:了解21聚体反义硫代脱氧寡核苷酸(AODN)体外对CVB3、CVB5持续感染的抑制作用。方法:人工合成AODN,进行脂质体包埋,并按不同浓度分别加入CVB3-ECV304、CVB5-ECV304持续感染细胞模型。对药物作用后持续感染细胞模型,观察其培养上清液致Vero细胞病变能力的改变;ELISA法检测CVB3、CVB5抗原产生的抑制率;RT-PCR检测细胞内病毒RNA表达情况;ELISA检测培养上清液分泌TNF-α浓度。同时进行正义和随机寡核苷酸(SODN、RODN)抗病毒能力检测,并与AODN结果比较。结果:AODN可抑制持续感染CVB3、CVB5抗原合成,随药物浓度的增高,抗原抑制率也升高;经AODN作用后,持续感染细胞培养上清液致Vero细胞病变能力下降,上清液中病毒滴度减少;RT-PCR在经AODN作用的CVB3-ECV304、CVB5-ECV304组中未检测到病毒RNA;经AODN作用后,持续感染的CVB3-ECV304、CVB5-ECV304细胞产生TNF-α浓度升高;针对CVB35′端非编码区基因组序列合成的AODN对CVB5持续感染也有较强的抑制作用;AODN对持续感染病毒的抑制作用强于SODN和RODN组。结论:AODN能体外抑制CVB3、CVB5持续感染,刺激细胞合成TNF-α。这种作用有序列特异性,但同组间病毒有交叉抑制作用,这种作用可能与CVB3、CVB5基因序列同源有关。

硫代反义寡核苷酸药物FT19有关物质的分析

为了进行硫代反义寡核苷酸药物FT19的质量控制研究,建立了用阴离子交换高效液相色谱(AX-HPLC)和毛细管凝胶电泳(CGE)分析自行合成的FT19有关物质的方法。设计合成了FT19的硫代不完全序列(P=O)1和短序列(n-x)并将它们作为已知杂质。在AX-HPLC上,使用的分析柱为DNAPacPA-100(4mm×250mm);流动相A为10mmol/LNaOH-0.1mol/LNaCl,流动相B为10mmol/LNaOH-3mol/LNaCl;梯度洗脱条件为流动相B液在8min内从60%升至100%;流速1mL/min;柱温40℃;检测波长为260nm。CGE所用毛细管规格为内径100μm,总长度为31cm,有效长度为20cm;电泳缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)-硼酸-7mol/L尿素,pH8.5;采用电动进样,进样电压-10kV;分离胶为250g/L的聚丙烯酰胺;检测波长为254nm。结果表明,FT19与硫代不完全的(P=O)1序列在AX-HPLC上能够达到基线分离,与短序列(n-1)在CGE上能达到基线分离。说明AX-HPLC和CGE联合应用能够很好地分析FT19中的有关物质。

离子对反相液相色谱法分析硫代寡核苷酸药物流感泰得的有关物质

建立了离子对反相液相色谱(IP-RPLC)分析流感泰得(Flutide)有关物质的方法,并将其与其它两种常用方法(离子交换色谱(IEC)和毛细管凝胶电泳(CGE)法)的分析结果进行比较。合成了Flutide及其单核苷酸缩短序列5'n-1、3'n-1和单氧代序列5'(P=O)1,将它们作为已知杂质,在IP-RPLC上进行分离条件的优化,使用的分析柱为XTerra MS C18柱(250 mm×4.6 mm,3.5μm);流动相A为142 mmol/L HFIP-36 mmol/L TEA-10%甲醇(V/V),流动相B为甲醇;梯度洗脱;流速为0.5 mL/min;柱温为50℃;检测波长为260 nm。结果表明,在该条件下,Flutide能同时与这几种杂质进行分离,其中与缩短序列5'n-1和3'n-1可实现基线分离,而与5'(P=O)1之间的分离度也能达到0.94。所建立的IP-RPLC方法已成功应用于Flutide粗品和纯品中各类杂质的分析和鉴定。

反义VEGF硫代寡脱氧核苷酸抑制裸鼠人肝癌移植瘤生长的研究

目的 :检测硫代修饰的反义脱氧寡核苷酸 (ASPODN)抑制人肝癌血管形成和生长的作用 ,以探讨ASPODN的临床应用前景。方法 :传代培养的肝癌细胞系HepG2 ,接种于裸鼠颈背部皮下 ,自 4 8h始局部注射ASPODN和等量的PBS ,彩色多普勒能量图 (CDE)检测移植瘤内新生血管的数目和分布 ;LSAB法免疫组化染色检测移植瘤中微血管密度 (MVD) ;FCM分析裸鼠移植瘤细胞周期动力学和凋亡率。结果 :局部注射ASPODN组和PBS对照组 ,裸鼠人肝癌移植瘤瘤重及MVD平均值分别为 ( 1.2 8±0 .2 6)g、2 6.90± 7.4 2和 ( 3.4 6± 0 .86)g、50 .36± 10 .2 7(P <0 .0 1) ;局部注射ASPODN组 ,用CDE动态检测到移植瘤内的血管数目及血流丰富程度明显低于PBS组P <0 .0 1;经ASPODN治疗后的裸鼠人肝癌移植瘤细胞凋亡率 ( 7.4 8± 1.64) %高于PBS对照组 ( 2 .75± 0 .2 2 ) % (P <0 .0 1)。结论 :VEGFAS PODN明量抑制肝癌血管形成和生长 。

用IE-HPLC、PAGE分析合成的硫代寡核苷酸相关物质“n-1”、“n-2”和“n-3”

目的:分析合成的n=20-mer硫代寡核苷酸中相关物质“n-1”、“ n-2”和“ n-3”杂质失败序列。方法:离子交换高效液相色谱(IE-HPLC)法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)。色谱柱为Gen-Pak^(TM)FAX离子交换柱(4.6 mm×100mm),流动相A为62.5mmol·L^(-1)三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris·Cl),pH 8.15,流动相B为62.5mmol·L^(-1) Tris·Cl,pH 8.15,2.5 mol·L^(-1) LiCl,流动相C为100％乙腈;梯度洗脱条件为B:30％→50％ 30 min,C:恒为20％;流速为0.75mL·min^(-1);检测波长为260nm。PAGE分析采用20％变性聚丙烯酰胺凝胶,恒定功率25W进行电泳。结果:IE-HPLC分离纯化出3种相关物质,通过PAGE印证了它们是由于合成偶联不完全而产生的n-1、n-2和n-3的杂质失败序列。结论:所用离子交换高效液相色谱法能将合成的硫代寡核苷酸中相关物质“n-1”、“n-2”和“n-3”杂质失败序列与全序列n一一分离出来,对硫代寡核苷酸的纯化和分析具有重要的参考价值。