反义硫代磷酸寡核苷酸逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究

目的 观察反义硫代磷酸寡核苷酸 (ASOND)逆转耐药肝癌细胞的多药耐药作用。方法 用人工合成互补于mdrl基因 5′端AUG起始密码子的反义 2 0聚硫代磷酸寡核苷酸 ,以Lipofectamine为载体 ,转染人耐药肝癌细胞SMMC 772 1,MTT测定细胞对化疗药物的敏感性 ,通过RT PCR检测mRNA的表达 ,流式细胞仪分析P 170的表达。结果 ASOND可抑制SMMC 772 1细胞mRNA及P 170的表达 ,增加耐药细胞对化疗药物的敏感性 ,最佳ASOND作用浓度为 0 .5 μmol/L。 结论 ASOND可增加耐药细胞对化疗药物的敏感性 ,部分逆转耐药肝癌细胞耐药。

bcl-2反义硫代磷酸寡核苷酸对模拟缓解骨髓中白血病细胞的凋亡诱导作用

目的探讨bcl-2反义碗代磷酸寡核苷酸（AS-ODN）对模拟缓解骨髓中白血病细胞的凋亡诱导作用。方法将模拟急性髓性白血病缓解骨髓（正常骨髓与HL-60细胞按1000：1的比例混合）分别与终浓度为10μM的bcl-2反义寡核苷酸（反义组）和bcl-2正义寡核苷酸（正义组）共培养72小时，同时设置空白对照组，观察细胞凋亡现象。结果反义组药物作用48～72小时后，流式细胞仪和DNA电泳检测到反义组出现细胞凋亡现象，而空白对照组和正义组均未检测到细胞凋亡现象。结论bcl-2AS-ODN可诱导模拟缓解骨髓中白血病细胞的凋亡，是其应用于体外净化的基本条件。

大剂量Bcl-2反义硫代磷酸寡核苷酸对细胞系的毒性作用

目的 探讨大剂量Bcl 2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸 (AS PS ODN ,ASPO)对HL6 0细胞系的毒性作用 ,同时了解毒性与剂量的关系。方法 应用四氮唑蓝比色法、台盼蓝拒染试验 ,CFU HL6 0克隆培养法观察大剂量Bcl 2ASPO对HL6 0细胞的毒性作用 ,同时应用免疫细胞化学染色及流式细胞仪检测P2 6Bcl 2蛋白表达 ,吖啶橙染色及DNA片段电泳对细胞凋亡的观察。并以其正义PS ODN(SPO)为反义序列非特异性毒性对照。用SPSS软件包进行剂量 效应曲线直线化回归分析。结果 (1)当ASPO、SPO剂量为 2 0 μmol/L时 ,即出现对HL6 0细胞生长的非特异性毒性作用 ;在 16 0μmol/L时 ,其非特异性毒性出现明显增加。对HL6 0细胞生长的抑制率分别为 40 %、18%。 (2 )量效曲线回归分析表明当剂量为 2 6 2 μmol/L时 ,ASPO与SPO的毒性作用无差别。 (3) 16 0 μmol/LASPO、SPO对Bcl 2蛋白表达率分别为 2 8%、78% ,将ASPO、SPO作用后的HL6 0细胞进行克隆传代发现Bcl 2表达阳性率反跳分别达 99.6 %、97.8%。结论 Bcl 2ASPO虽为低毒药物 ,但仍存在剂量依赖性毒性作用。其对HL6 0细胞作用的适合剂量以不超过

硫代磷酸反义寡核苷酸prop5对流感病毒进入细胞的抑制作用

目的研究硫代磷酸反义寡核苷酸prop5对流感病毒感染进入细胞的影响。方法采用流感病毒感染A549细胞模型,设立随机序列(prop5R)和正义序列(prop5S)作为阴性对照,收集细胞培养液,采用实时荧光定量PCR检测病毒RNA拷贝数,评价反义寡核苷酸对病毒吸附和进入的影响;进一步通过血凝抑制实验检测prop5对流感病毒吸附细胞的影响,溶血抑制实验检测prop5对流感病毒进入细胞的影响。结果 prop5能够抑制流感病毒A/Jingfang/1/86(H1N1)感染A549细胞,对流感病毒吸附细胞过程没有影响,prop5能够抑制A/Jingfang/1/86(H1N1)、A/Lufang/9/93(H3N2)、A/FM/1/47(H1N1)和A/PR/8/34(H1N1)介导的膜融合。结论 prop5能抑制流感病毒进入细胞,这种额外的活性增强了prop5的抗病毒能力。

硫代磷酸化修饰的反义 TGF-β1寡核苷酸抑制血管损伤后内膜增殖

目的:探讨反义转化生长因子β1(TGF-β1)寡核苷酸对血管损伤后血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转变的影响及对内膜增殖的作用。方法:在跨过TGF-β1cDNA序列的起始密码区ATG范围内,设计含15个碱基、无修饰或硫代磷酸化修饰的反义TGF-β1寡核苷酸(AS TGF-β1)及对照的正义(与反义寡核苷酸互补)寡核苷酸(S TGF-β1)。球囊导管损伤SD大鼠颈总动脉,术后7 d取出正常或损伤的血管进行VSMCs的培养,RT-PCR及蛋白印迹分别检测VSMCs生物学标志平滑肌22α蛋白(SM22α)、基质Gla蛋白和骨桥蛋白,以及TGF-β1和纤维连结蛋白(fibronectin,FN)mRNA和蛋白质的表达。采用ALZET泵皮下注射硫代磷酸化修饰AS TGF-β1及S TGF-β1(90μg·kg-1·d-1),连续给药28 d后测定血管内膜与中膜的面积比(I/M)。结果:(1)AS TGF-β1对血管损伤后VSMCs TGF-β1mRNA表达并无明显作用,但呈浓度依赖性抑制TGF-β1蛋白质的表达,而S TGF-β1不影响TGF-β1mRNA和蛋白质的表达。(2)AS TGF-β1呈浓度依赖性抑制血管损伤后VSMCs DNA的合成,而不管是AS TGF-β1还是S TGF-β1对正常VSMCs DNA的合成均无明显的量效作用;同时AS TGF-β1显著抑制了血管损伤后VSMCs FN的合成。(3)AS TGF-β1显著促进了VSMCs SM22αmRNA的表达,但抑制了基质Gla蛋白和骨桥蛋白mRNA的表达,这种相反的作用在0.01及0.1μmol/L的水平最为明显。(4)硫代磷酸化修饰的AS TGF-β1治疗28 d后,显著抑制了颈动脉损伤后新生内膜的增殖,I/M比对照组下降了68%。结论:AS TGF-β1特异性抑制了VSMCs TGF-β1蛋白的表达,抑制血管损伤后VSMCs增殖及合成、分泌FN,减轻血管损伤后新生内膜的增殖。上述作用可能与逆转血管损伤后VSMCs的表型转变有关。

反义核酸药物硫代磷酸酯寡核苷酸

对一类颇有应用前景的反义核酸药物硫代磷酸酯寡核苷酸的合成技术、反义特性、作用原理及药物动力学等几方面的最新研究进展，作了较为详尽的论述。

肝细胞靶向性脂质体介导的硫代磷酸反义寡核苷酸在体内外抑制乙型肝炎病毒的研究

在体外细胞培养系统和裸鼠动物体内,观察了人肝细胞靶向性脂质体介导的部分硫代型和全部硫代型反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒的抑制作用。结果显示,针对HBVe基因翻译起始区的18聚体的硫代磷酸反义寡核苷酸在体内、外对HBV DNA、HBV mRNA及HBsAg、HBeAg均有不同程度的抑制作用。研究说明,反义寡核苷酸是抗HBV有效的基因治疗候选药物。

反义寡核苷酸的作用机制及其在运动系统中的研究进展

反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASOs)是一类新型的小分子基因靶向药物,可与目的mRNA结合,ASOs以其与目标序列互补的碱基配对方式,对基因进行靶向调控。随着基因测序技术和分子合成技术的不断发展,ASOs在运动系统中的研究和应用进一步深入。本文阐述了ASOs在基因沉默和表达调控中的作用机制,以及其在基因治疗方面的应用前景。此外,还介绍了ASOs在运动系统疾病中的研究进展和应用情况,并分析此类药物目前所面临的问题,旨在深化医务人员对ASOs的认识,并为其在生物医学研究和临床中的推广应用提供有益参考。

反义寡核苷酸药物在神经系统疾病治疗中的研究与应用

神经系统疾病的病因及病理机制复杂且研究难度大,靶点发现及相应的药物研发困难。随着基因组及转录组测序等技术的发展,有关神经系统疾病的遗传形式、非遗传性或散发性神经系统疾病的靶点发现及分子机制取得了有效进展。基于转录组靶点发现的小核酸药物研发为神经系统疾病的新药开发领域提供了一种新的思路。反义寡核苷酸药物属于小核酸药物的一种,相比于以蛋白为靶点的传统小分子药或抗体药物,靶向mRNA的反义寡核苷酸具有候选靶点范围大、药物靶点筛选快、研发成功率高等优点。目前,反义寡核苷酸药物在神经退行性疾病领域的治疗广受各药物研发企业重点关注,具有良好临床应用前景。本研究总结反义寡核苷酸药物在多种神经系统疾病治疗中的研究与应用,回顾其作用机制、研发优势以及结构修饰方法的发展,并探讨用于治疗神经系统疾病的反义寡核苷酸药物临床用药及研发的最新进展,旨在为神经系统疾病、尤其是罕见病及难治病的新药研发提供借鉴和参考。

阿斯利康反义寡核苷酸药物获FDA批准上市

近日,阿斯利康宣布美国食品药品管理局(FDA)已批准反义寡核苷酸(ASO)疗法Eplontersen(商品名:Wainua)上市,用于治疗成人遗传性转甲状腺素蛋白(TTR)介导的淀粉样变性的多发性神经病(ATTRv-PN)。

硫代磷酸反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒基因表达的体外抑制作用

目的：研究硫代磷酸反义寡核苷酸(ASON)的抗丙型肝炎病毒(HCV)作用。方法：针对HCV结构基因C区(含AVG)设计合成了18聚线性硫代磷酸ASON和自身稳定性ASON，通过体外无细胞转录、翻译系统定量分析核心蛋白表达情况。结果：ASON对HCV基因表达有明显的抑制作用，当ASON浓度为2.0μmol/L时，抑制率为82.6％～84.9％，ASON浓度大于4.0μmol/L时、抑制率呈平台趋势。线性ASON和自身稳定性ASON对HCV的抑制效果相似。结论：ASON可抑制HCV基因表达，有可能成为抗HCV的一种有效制剂。

硫代磷酸酯寡核苷酸的合成及其对内皮细胞组织因子(Tissue factor,TF)基因表达及TF促凝活性的作用

为合成与 TF基因启动子区切应力反应元件 ( Shear stress responsive element,SSRE)形成三链 DNA的硫代磷酸酯寡核苷酸 ( Triple helix- forming phosphorothioate oligodeoxynucleotides,TFO- ps) ,探讨其对内皮细胞TF基因表达及 TF促凝活性的影响。我们设计反向 TFO ( T2 1GTa)序列 ,采用固相亚磷酰胺三酯固相法合成TFO。在 TFO的 3′末端进行硫代磷酸酯修饰。应用电泳迁移分析 ( Electrophoretic mobility shift assays,EMSA)观察寡核苷酸和硫代脱氧寡核苷酸的亲和性。在 ECV3 0 4内皮细胞株观察 γ- 32 P标记硫代磷酸酯 TFO的细胞摄取及其对 TF基因表达的影响。结果显示 ,TFO- ps( T2 1Gta- ps)与靶序列能形成三链 DNA,其 Kd值为 3 .6× 10 - 1 0 M。在内皮细胞株 ECV3 0 4细胞 ,TFO- ps( T2 1GTa- ps)的细胞吸收率为 11.65 % ,主要分布在核沉淀 ,约占吸收总量的77.2 5 % ,显著降低内皮细胞 TF基因 m RNA表达及 TF蛋白合成的平均光密度 ( AOD)值 ,显著降低 TF的促凝活性。以上结果表明 ,TFO- ps( T2 1GTa- ps)具有较好的抗凝活性 ,其机制与抑制

新型c-Myc反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸在小鼠体内的药动学

目的 :研究新筛选合成的c Myc基因反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸 (antisensephosphorothioateoligodeoxynucleotidestoc Myc ,c MycAS PS ODN )在小鼠体内的药动学、组织分布和排泄情况。方法 :给小鼠按 5 ,10 ,2 0mg·kg- 13个剂量静脉注射3H c MycAS PS ODN后 ,液闪仪测定不同时间点血浆药物浓度 ;按 10mg·kg- 1静脉注射3H c MycAS PS ODN ,测定不同时间组织器官中3H c MycAS PS ODN的含量和其在粪、尿中排泄率 ,药动学统计程序拟合分析。结果 :静脉注射后 3种剂量血浆药物浓度 时间曲线均符合二室分布模型 ,3种剂量下的AUC之间有明显的线性关系 ;多数组织药物分布浓度 2h达高峰 ,肝、脾、肾、肺和骨髓中药物浓度较高 ,2 4h尿、粪总排泄率 82 %。结论 :c MycAS PS ODN在体内分布快 ,除脑、生殖腺等亲脂性组织外 ,其他组织含量高 ;主要通过尿液排泄。

抑制脑血栓形成的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸的亲和性研究

目的为抑制脑血栓形成,合成与TF基因启动子区切应力反应元件(SSRE)形成三链DNA的硫代磷酸酯寡核苷酸(TFO)。方法设计TFO序列14条,采用固相亚磷酰胺三酯固相法合成TFO。硫代磷酸酯修饰在TFO的3'末端进行。应用电泳迁移分析(EMSA)观察寡核苷酸和硫代脱氧寡核苷酸的亲和性。结果在设计合成的14条寡核苷酸中,与靶序列能形成三链DNA的TFO只有T21GTa、T14GTa和T15GTa,其Kd值分别为3.6×10-10、1.0×10-9和1.0×10-8(M),经硫代磷酸酯修饰后分别为:2.3×10-9、3.8×10-9和1.5×10-8。结论硫代磷酸酯修饰的T21GTa-ps、T14GTa-ps和T15GTa-ps能够与TF基因启动子SSRE的3个位点形成三链DNA。

BCL-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸对原代急性白血病细胞选择性抑制作用

为探讨BCL-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS-PS-ODN,ASPO)对急性原代白血病细胞和正常或良性血液病骨髓细胞的作用是否存在差别。应用台盼蓝拒染试验测定细胞存活力;用造血祖细胞集落培养:粒—单系祖细胞集落(CFU-GM),多向祖细胞集落(CFU-Mix),后红系祖细胞集落(CFU-E)、前红系祖细胞集落(BFU-E)和白血病祖细胞集落(CFU-AML,CFU-ALL)培养检测细胞增殖能力;免疫细胞化学染色检测细胞BCL-2蛋白表达变化。结果发现(1)正常或良性血液病骨髓细胞经10μmol/L ASPO处理一周,同对照组比较:细胞生长数、CFU-GM、CFU-Mix、CFU-E、BFU-E及BCL-2蛋白表达均无显著差别(P<0.05)。(2)急性原代白血病细胞经5μmol/L ASPO处理一周,同对照组比较:细胞生长数显著减低;CFU-AML或CFU-ALL显著降低(P < 0.05),而CFU-GM明显增高(P< 0.05);对照组BCL-2蛋白表达率为77.92％±22.50％,ASPO组于培养的第3天为54.05％±20.20％(P<0.01)和第6天为55.35％±22.74％(P<0.05)均显著低于对照组。因此认为BCL-2ASPO具有选择性地抑制白血病细胞的增殖和BCL-2蛋白的表达的作用。

自稳定硫代磷酸寡核苷酸的合成及其在血液中的稳定性

目的：探讨自行设计的自稳定硫代磷酸寡核苷酸在血液中的稳定性。方法：在ＤＮＡ自动合成仪上合成硫代磷酸寡核苷酸和普通磷酸二酯键寡核苷酸，经高效液相仪纯化和３２Ｐ标记后，两者一起在２０％血清中３７℃温育０，１，４，８及３２ｈ，酚抽提后，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较两者的降解率。结果：自稳定硫代磷酸寡核苷酸在各时相点均为完整形式，普通磷酸二酯键寡核苷酸在以上５个时相点的降解率分别为０．０％，７７．２％，８３．０％，８４．４％和８５．３％。结论：自稳定硫代磷酸寡核苷酸在血液中有较强的稳定性。

高效液相色谱法测定C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸血清浓度

目的 :建立C sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸 (C sisPS AODN)血清浓度测定的HPLC法。方法 :采用醋酸缓冲液 乙腈 水 (3∶9∶88)流动相 ,氰基色谱柱 ,采用乙腈沉淀的样品处理方法。结果 :C sisPS AODN在 1 9.6～31 4 .0 μg·mL- 1 血清浓度范围内线性良好 ,r =0 .9998,回收率为 (97.9± 3 .3) % ,日内和日间变异系数均在 1 .4%～8.2 %范围内。结论 :本方法适用于C sisPS AODN体内。

反义寡聚硫代磷酸脱氧核糖核苷酸的抗巨细胞病毒作用

目的 研究互补于CMV主要即刻早期 (MIE)mRNA的起始密码子位点和MIEmRNA前体内含子 1/外显子 2拼接位点的 2个 19个碱基的ASS ODN (AS1和AS2 )对CMV复制的抑制作用。方法 采用原位ELISA法测定 2BS细胞上CMV抗原量。结果 2个S ODN均有抗CMV作用 ,半数有效浓度 (EC50 )分别为 4 5 3和 10 2 μmol·L-1。 8 0 μmol·L-1的AS1使CMV抗原分泌推迟 3～ 4d。感染后立即加药效果最好 ,12h后加药效果大大下降 (P <0 0 5 ) ,感染后 36h再添加同一剂量及与DHPG联合使用效果明显增强 (P <0 0 5 )。 2种ASS ODN 6 4 0 μmol·L-1时仅有轻微的细胞毒性 ,16 0 μmol·L-1以下浓度无明显毒副作用。采用 5mg·L-1的脂质体使 2种S ODN的EC50 分别降低了 111 0和 15 1 7倍。 2种正义序列对照也显示出抑制效应 ,EC50 分别为 2 6 2和 30 1μmol·L-1。NorthernBlot分析提示激活RNA酶H降解杂交双链中的mRNA分子为重要的特异性作用机制 ,而干扰CMV对细胞的吸附与侵入为重要的非特异性作用机制。结论 作用于MIE基因的ASS ODN可有效地抑制CMV复制 。

反义硫代磷酸酯寡聚核苷酸及其应用研究进展

硫代磷酸酯寡聚核苷酸(PS-ODN)是一类颇有应用前景的反义核酸,本文结合最新研究进展,就PS-ODN作为反义药物所需具备的条件和在抗病毒、抗肿瘤及遗传学分析和分子生物学研究中的应用作了较为详尽的论述。

反义硫代磷酸酯寡聚核苷酸及其专一性

反义硫代磷酸酯寡聚核苷酸及其专一性１）刘红魏东芝２）（华东理工大学生物化学研究所生物反应器工程国家重点实验室，上海２００２３７）反义核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）包括反义ＤＮＡ、反义ＲＮＡ和Ｒｉｂｏｚｙｍｅ三种．根据碱基互...