卷曲螺旋结构域蛋白2通过促进线粒体自噬抑制帕金森病SH-SY5Y细胞凋亡

背景:卷曲螺旋结构域蛋白2(coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing 2,CHCHD2)能否调控PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在帕金森病中发挥神经保护作用尚未可知。目的:探讨CHCHD2在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中对PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬发挥的作用及机制。方法:利用重组质粒转染技术过表达或敲低CHCHD2,用6-羟基多巴胺构建SH-SY5Y细胞帕金森病模型后分对照组、模型组、过表达阴性对照+6-羟基多巴胺组、敲低阴性对照+6-羟基多巴胺组、过表达CHCHD2+6-羟基多巴胺组和敲低CHCHD2+6-羟基多巴胺组。Western blot及RT-qPCR检测CHCHD2的表达;Western blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、MFN1、COXⅣ、DRP1、PINK1、Parkin、TIM23、Bax、Bcl-2及cleavedcaspase3蛋白表达;CCK-8、JC-1和活性氧试剂盒检测细胞活性、线粒体膜电位和活性氧水平,单丹磺酰尸胺染色观察细胞自噬情况,透射电镜观察自噬溶酶体。结果与结论:①与对照组相比,模型组细胞活性、线粒体膜电位及CHCHD2、PINK1、Parkin蛋白表达降低,活性氧水平、凋亡水平及LC3Ⅰ/Ⅱ、p62蛋白表达升高(P<0.05),并观察到自噬溶酶体的存在;②与模型组相比,过表达CHCHD2能降低细胞活性氧水平,升高线粒体膜电位及PINK1、Parkin和MFN1蛋白表达水平,并观察到线粒体自噬溶酶体增多,而敲低CHCHD2后有与上述相反的作用,并伴有COXⅣ、TIM23和p-DRP1蛋白表达的升高(P<0.05);③与模型组相比,过表达CHCHD2能减少细胞凋亡,上调Bcl-2并下调Bax及cleavedcaspase3蛋白的表达,而敲低CHCHD2后有与上述相反的作用(P<0.05);④结果提示,CHCHD2在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中可以通过促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬改善线粒体功能从而减轻细胞凋亡发挥神经保护作用。

法舒地尔缓解β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

背景:法舒地尔对阿尔茨海默病小鼠脑内的线粒体动力学有调节作用,并且可以抑制神经炎症,但能否调节线粒体自噬和NLRP3炎症小体进而减轻β-淀粉样蛋白毒性尚不清楚。目的:探究法舒地尔对β-淀粉样蛋白1-42诱导的人源神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y凋亡和线粒体自噬以及NLRP3炎症小体的调节作用。方法:将SH-SY5Y细胞接种于孔板内,细胞贴壁后分3组干预:对照组不加入任何药物,模型组加入20μmol/L β-淀粉样蛋白1-42,法舒地尔组同时加入20μmol/L β-淀粉样蛋白1-42与15 mg/L法舒地尔,干预24 h后,采用MTT法检测细胞活性,TUNEL染色检测细胞凋亡,qRT-PCR和Western blot检测凋亡相关蛋白表达,免疫荧光染色和Western blot检测线粒体自噬相关蛋白表达,免疫荧光染色和Western blot检测NLRP3炎症小体相关蛋白表达。结果与结论:(1)与对照组比较,模型组细胞活性降低、凋亡率升高(P<0.05);与模型组比较,法舒地尔组细胞活性升高、凋亡率降低(P<0.05);(2)qRT-PCR和Western blot检测结果显示,与对照组比较,模型组细胞Bax mRNA与蛋白表达升高(P<0.05),Bcl-2 mRNA与蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,法舒地尔组细胞Bax mRNA与蛋白表达降低(P<0.05),Bcl-2 mRNA与蛋白表达升高(P<0.05);(3)免疫荧光染色和Western blot检测结果显示,与对照组相比,模型组细胞PINK1、帕金森病蛋白和LC3蛋白表达降低(P<0.05),p62蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,法舒地尔组细胞PINK1、帕金森病蛋白和LC3蛋白表达升高(P<0.05),p62蛋白表达降低(P<0.05);(4)免疫荧光染色和Western blot检测结果显示,与对照组相比,模型组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,法舒地尔组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白表达降低(P<0.05);(5)结果表明,法舒地尔可以减轻β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,其机制可能与激活线粒体自噬且抑制NLRP3炎症小体激活有关。

堆型艾美耳球虫裂殖子外分泌蛋白对细胞凋亡的抑制作用

为了研究堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)裂殖子的外分泌蛋白对马-达氏牛肾(MDBK)细胞凋亡的抑制作用,本试验建立Transwell小室间接共培养体系,即将E.acervulina裂殖子与MDBK细胞共培养,采用流式细胞术分别检测共培养1.5、3和6 h MDBK细胞的凋亡情况,利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对共培养6 h后的细胞上清液中的成分进行鉴定。结果显示,1.5、3和6 h共培养组MDBK细胞的总细胞凋亡率分别为(5.92±0.19)%、(8.13±0.32)%和(11.57±0.37)%,与对照组相比,总细胞凋亡率均极显著降低(P<0.01)。LC-MS/MS分析共鉴定到65个E.acervulina的外分泌蛋白,包括热休克蛋白、微线蛋白、能量代谢酶分子、蛋白磷酸酶分子和未知功能蛋白等。结果表明,E.acervulina裂殖子外分泌蛋白可抑制MDBK细胞凋亡,具体哪种蛋白在抑制细胞凋亡中发挥作用有待后续进一步研究。

有氧运动上调硫氧还蛋白系统抑制衰老大鼠心肌细胞凋亡

背景:研究表明,心肌细胞凋亡与心脏功能减退及心脏衰老过程密切相关,适宜的运动可以改变心力衰竭患者的心泵功能以及减轻衰老引起的心肌细胞凋亡、肥大和纤维化损伤。目的:探究长期有氧运动对衰老大鼠心肌细胞凋亡及硫氧还蛋白系统的影响。方法:选取雄性SD大鼠36只,按照鼠龄分为青年组(3月龄)、中年组(9月龄)、老年组(18月龄),每组12只;每组又分为安静、运动2个亚组,每组6只,安静组常规饲养,运动组进行有氧运动训练(45 min/d,5 d/周,训练10周)。末次训练后24 h,采用ELISA法检测大鼠血清肌钙蛋白Ⅰ和血清肌酸激酶同工酶MB水平,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,Western Blot检测大鼠心肌组织中Bax、Bcl-2、Caspase 3、硫氧还蛋白1、硫氧还蛋白2、硫氧还蛋白还原酶1、硫氧还蛋白还原酶2、硫氧还蛋白相互作用蛋白、凋亡信号调节激酶1、P38丝裂原活化激酶的蛋白表达。结果与结论:(1)老年安静组大鼠血清肌钙蛋白Ⅰ和肌酸激酶同工酶MB水平高于青年安静组、中年安静组、老年运动组(P <0.01),老年运动组大鼠血清肌钙蛋白Ⅰ和肌酸激酶同工酶MB水平高于青年运动组、中年运动组(P <0.01);(2)无论是安静状态还是运动训练后,随着鼠龄的增加,大鼠凋亡心肌细胞数量及Bax、Caspase 3蛋白表达逐渐升高,Bcl-2蛋白表达逐渐降低;与同龄段安静组相比,运动组大鼠凋亡心肌细胞数量及Bax、Caspase 3蛋白表达均不同程度降低,Bcl-2蛋白表达均不同程度升高;(3)老年安静组大鼠心肌硫氧还蛋白1、硫氧还蛋白2、硫氧还蛋白还原酶1、硫氧还蛋白还原酶2蛋白表达低于青年安静组、中年安静组、老年运动组(P <0.05,P <0.01);老年运动组大鼠心肌硫氧还蛋白1、硫氧还蛋白2、硫氧还蛋白还原酶2蛋白表达低于青年运动组(P <0.05,P <0.01),硫氧还蛋白还原酶1、硫氧还蛋白还原酶2蛋白表达低于中年运动组(P <0.01);(4)老年安静组大鼠心肌硫氧还蛋白相互作用蛋白、凋亡信号调节激酶1、P38丝裂原活化激酶蛋白表达高于青年安静组、中年安静组、老年运动组(P <0.01),老年运动组大鼠心肌硫氧还蛋白相互作用蛋白、凋亡信号调节激酶1、P38丝裂原活化激酶蛋白表达高于青年运动组、中年运动组(P <0.01);(5)结果表明,有氧运动可能通过下调硫氧还蛋白相互作用蛋白表达来增强硫氧还蛋白的表达,下调凋亡信号调节激酶1及P38丝裂原活化激酶蛋白的表达,从而减轻衰老大鼠心肌细胞的凋亡。

Y-box结合蛋白1通过沉默信息调节因子1 mRNA稳定性调节抑制人颗粒细胞凋亡在早发性卵巢功能不全中的作用与机制

目的:探讨Y-box结合蛋白1(YBX1)调节沉默信息调节因子1(SIRT1)对颗粒细胞增殖和凋亡的影响,研究YBX1和SIRT1在早发性卵巢功能不全(POI)患者及卵巢功能正常患者间表达水平差异及临床意义。方法:留取2022年6月至2023年7月于江苏大学第四附属医院生殖医学中心进行体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕的POI患者(POI组)及卵巢储备功能正常患者(对照组)的颗粒细胞和血清,利用免疫印迹(WB)检测YBX1蛋白表达水平;利用实时荧光定量核酸扩增法(RT-qPCR)检测YBX1及SIRT1 mRNA表达水平,并分析血清中其与卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E_(2))、抗苗勒管激素(AMH)、窦卵泡数(AFC)的相关性;利用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(EdU)、细胞计数试剂8(CCK8)检测细胞增殖、原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;RT-qPCR检测细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达情况;RNA免疫沉淀(RIP)实验检测YBX1与SIRT1的相互作用。结果:与对照组患者相比,POI组患者颗粒细胞和血清中YBX1蛋白及SIRT1 mRNA的表达降低(P<0.05);血清中YBX1、SIRT1 mRNA表达与FSH、LH负相关(r<0,P<0.05),与E_(2)、AMH、AFC正相关(r>0,P<0.05);在颗粒细胞中上调YBX1后SIRT1蛋白表达量、SIRT1 mRNA的稳定性、EdU阳性率、细胞活性、PCNA mRNA表达量、Bcl2/BAX比值均增加(P<0.05),Caspase-3 mRNA表达量、TUNEL阳性率均降低(P<0.05)。结论:YBX1和SIRT1在POI患者中表达水平显著下调,且其表达水平与临床卵巢功能指标相关;YBX1结合SIRT1 mRNA增强其稳定性,可能促进颗粒细胞增殖,抑制细胞凋亡,提示YBX1和SIRT1有望成为POI诊疗的新靶点。

X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1通过自噬途径调控Caspase 1介导的胃肠道间质瘤细胞焦亡

目的:探究X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)对人胃肠道间质瘤(GIST)细胞中半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase 1)介导的细胞焦亡的影响及机制。方法:实时荧光定量PCR和Western blot检测人正常胃黏膜上皮细胞系(RGM-1)和GIST细胞系(GIST-T1、GIST-430、GIST-882)中XAF1的表达水平;采用脂质体介导转染法将pcDNA3.1-XAF1重组质粒染进GIST-882细胞,以构建高表达XAF1的GIST-882细胞。GIST-882细胞分为对照组、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1空载体质粒)、pcDNA3.1-XAF1组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒)、pcDNA3.1-XAF1+Rap组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒并给予自噬激活剂雷帕霉素处理),免疫荧光染色检测各组细胞内微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,Western blot检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与Beclin1蛋白表达水平,ELISA法检测各组细胞上清中白细胞介素,IL-1β、IL-18含量,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测各组细胞LDH释放率,Western blot检测各组细胞中Caspase-1及其活化形式cleaved-Caspase-1、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平。结果:与RGM-1细胞比较,GIST-T1、GIST-430、GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量显著减少(P<0.05);细胞转染后,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量均显著高于pcDNA3.1组、对照组(P<0.05)。与对照组比较,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显减弱,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著减少(P<0.05),细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著升高(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著增加(P<0.05);与pcDNA3.1-XAF1组比较,pcDNA3.1-XAF1+Rap组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显增强,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著增加(P<0.05),同时,细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著下降(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著减少(P<0.05)。结论:XAF1在GIST细胞中表达下降,提高XAF1表达能通过抑制自噬从而促进Caspase 1介导的GIST细胞焦亡,发挥抗肿瘤作用。

骨桥蛋白反义核酸抑制乳腺癌细胞系增殖和诱导其凋亡

目的观察结合于骨桥蛋白(OPN)mRNA上低自由能区域的反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对OPN基因的抑制效应,以及对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞体外增殖和凋亡的影响。方法基于最小自由能算法,针对OPN mRNA上的低结合自由能区域设计合成ASODN,转染高表达OPN的人乳腺癌细胞系MCF-7;MTT法测定细胞增殖抑制率;电子显微镜下观察细胞形态学改变;RT-PCR检测OPN mRNA水平;流式细胞术检测细胞周期及凋亡发生率。结果OPN ASODN呈时间和剂量依赖性抑制MCF-7细胞增殖(P<0.05);经16μmol/L OPN ASODN作用72h,细胞呈典型凋亡特征;OPN mRNA表达水平下降;反义组凋亡细胞比例显著升高(P<0.01)。结论OPN ASODN在体外可抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖并诱导其发生凋亡;利用最小自由能原理来设计反义寡核苷酸是一种较为可靠的方法。

X连锁凋亡抑制蛋白反义寡核苷酸逆转K562细胞及难治性癫痫大鼠对卡马西平和苯妥英钠耐药性

凋亡在癫痫发生机制中起重要作用,但其在难治性癫痫耐药机制中的作用尚不清楚.为研究X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)反义寡核苷酸对K562/Dox(阿霉素诱导)耐药细胞及难治性癫痫大鼠耐药性的影响,首先建立耐药的K562/Dox细胞株,比较XIAP在耐药细胞株和正常K562细胞株的表达情况,观察转染XIAP反义寡核苷酸后,线粒体膜电位变化以及对卡马西平和苯妥英钠耐药性的影响.另外,建立慢性杏仁核点燃癫痫模型,筛选出耐药组和药物敏感组,通过侧脑室注射XIAP反义寡核苷酸,对照组注射生理盐水.观察其对各组大鼠后放电阈值(after dischargethreshold,ADT)、后放电时程(after discharge duration,ADD)等电生理指标的影响.结果发现,XIAP在K562/Dox耐药细胞上的表达明显高于正常K562细胞,XIAP反义寡核苷酸转染K562/Dox耐药细胞后,XIAP的表达明显下降.导致了K562/Dox细胞线粒体跨膜电位的下降,而且对苯妥英钠和卡马西平的耐药性明显下降,IC50分别由(1978.2±90.3)mg/L和(1875.6±83.2)mg/L,降低到(1123.5±54.2)mg/L和(1084.5±60.6)mg/L,逆转倍数分别为1.76和1.73.同时动物实验发现,耐药组大鼠在给予XIAP反义寡核苷酸后,ADT明显高于对照组(P<0.05),ADD时程也明显缩短.上述结果证明,XIAP在耐药的K562/Dox细胞株存在高表达,下调XIAP在K562/Dox细胞株表达可以改善K562/Dox对卡马西平和苯妥英钠的耐药性.而且下调XIAP表达可以协助AEDs改善耐药大鼠的电生理活动,提示XIAP参与了难治性癫痫的耐药.

沙眼衣原体T3SS效应蛋白CT622通过激活ERK/p38 MAPK信号通路抑制Hela299细胞凋亡

目的探究沙眼衣原体Ⅲ型分泌系统(T3SS)效应蛋白CT622对Hela299细胞凋亡的影响机制。方法设置不同质量浓度CT622蛋白刺激Hela299细胞,筛选最佳刺激质量浓度。将细胞实验分为PBS组(空白对照)、肿瘤坏死因子(TNF)-α组(阳性对照)、CT622组、CT622+TNF-α组、CT622+PD98059(ERK1/2抑制剂)组、CT622+SB203580(p38抑制剂)组、CT622+TNF-α+PD98059组、CT622+TNF-α+SB203580组。Hoechst33258染色和流式细胞术检测Hela299细胞的凋亡情况。Western blotting检测凋亡相关蛋白裂解的Caspase-3(cleaved-Casepase-3)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和凋亡信号通路中信号分子ERK/p38 MAPK蛋白的表达。结果5 mg/L CT622蛋白为Hela299细胞最佳刺激质量浓度。CT622蛋白显著抑制Hela299细胞的凋亡,并上调ERK1/2、p38 MAPK和Bcl-2蛋白表达,下调Bax和Caspase-3蛋白表达。分别利用ERK1/2和p38 MAPK抑制剂与CT622联合处理可以明显增加Hela299细胞凋亡程度。结论T3SS效应蛋白CT622通过激活ERK/p38 MAPK信号通路抑制Hela299细胞凋亡。

虫草素通过调控Dickkopf相关蛋白/β-catenin信号通路诱导自噬和凋亡抑制弥漫大B细胞淋巴瘤

目的:探究虫草素是否通过Dickkopf相关蛋白1(Dkk1)/β-catenin信号诱导自噬和凋亡抑制弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。方法:选择DLBCL SU-DHL-4细胞进行研究。MTT法检测细胞活性,用不同浓度虫草素处理DLBCL SU-DHL-4细胞,分为对照组和虫草素20、40、80μg/mL组。si-DDK1转染SU-DHL-4细胞,分为对照组、虫草素80μg/mL组和虫草素80μg/mL+si-DDK1组。流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光细胞化学检测微管相关蛋白轻链3(LC3)阳性细胞量,免疫印迹检测cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved多腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP1)、becline-1、自噬相关蛋白7(Atg7)、LC3Ⅱ,DDK-1和β-catenin蛋白相对表达量。结果:与对照组相比,经虫草素40、80μg/mL干预后,SU-DHL-4细胞凋亡率升高,LC3+阳性表达量显著增加,cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP1、becline-1、ATG7、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和DDK-1蛋白相对表达量均上调,而β-catenin蛋白相对表达量下调。与虫草素80μg/mL组相比,在虫草素80μg/mL+si-DDK1组中DDK-1蛋白相对表达量下调,而β-catenin蛋白相对表达量上调;同时SU-DHL-4细胞凋亡率降低,LC3+阳性表达量显著降低,cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP1、becline-1、ATG7和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相对表达量均下调。结论:虫草素可通过调控Dkk1/β-catenin信号诱导自噬和凋亡来抑制DLBCL。

蛋白酶体抑制剂MG132对人胃癌细胞MGC-803自噬、凋亡和迁移的影响

目的探究蛋白酶体抑制剂MG132对人胃癌细胞MGC-803自噬、凋亡和迁移的影响,分析其对上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达的影响。方法应用0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL和2.00μg/mL的MG132处理MGC-803细胞后,用激光共聚焦显微镜检测自噬小体数目的变化以分析其对自噬的影响,通过流式细胞仪检测细胞凋亡比例的变化,并通过Transwell细胞迁移实验检测MG132对细胞迁移能力的影响。通过免疫印迹实验检测细胞凋亡相关蛋白和EMT相关蛋白表达的变化。结果在MGC-803细胞中,与空白对照组比较,随着MG132药物浓度的升高,MG132对MGC-803细胞具有毒性作用;1.00μg/mL的MG132明显增加MGC-803细胞的自噬小体数目(1.00μg/mL:t=9.459,P=0.011);随着MG132浓度的升高,细胞凋亡比例明显增多(0.25μg/mL:t=5.149,P=0.036;0.50μg/mL:t=7.342,P=0.018;1.00μg/mL:t=15.340,P=0.004);Western blotting发现MG132处理MGC-803细胞后,随着药物浓度的增加,BAX表达明显增加(0.25μg/mL:t=4.646,P=0.043;0.50μg/mL:t=4.610,P=0.044;1.00μg/mL:t=10.760,P=0.009),Bcl-2表达明显降低(0.25μg/mL:t=22.850,P=0.002;0.50μg/mL:t=26.780,P=0.001;1.00μg/mL:t=29.890,P=0.001);随着MG132浓度的升高,迁移细胞数目明显减少(0.25μg/mL:t=16.730,P=0.004;0.50μg/mL:t=27.340,P=0.001;1.00μg/mL:t=32.800,P<0.001);0.50μg/mL浓度MG132改变EMT相关蛋白表达水平,E-钙黏蛋白表达明显升高(0.50μg/mL:t=4.405,P=0.048;1.00μg/mL:t=12.170,P=0.007),N-钙黏蛋白(0.50μg/mL:t=5.163,P=0.036;1.00μg/mL:t=6.811,P=0.021)和波形蛋白(0.50μg/mL:t=5.628,P=0.030;1.00μg/mL:t=12.670,P=0.006)表达明显降低。结论MG132处理人胃癌细胞MGC-803能促进细胞自噬和凋亡,并通过EMT进程抑制细胞迁移。

Mdivi-1通过抑制少突胶质细胞凋亡信号通路发挥髓鞘保护作用

目的:研究线粒体分裂抑制剂1(Mdivi-1)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠髓鞘保护中的作用,探讨Mdivi-1抑制髓鞘变性的机制。方法:小鼠经髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白第35~55位肽段(MOG35-55)免疫后,随机分为DMSO模型组和Mdivi-1干预组。于免疫后第28天处死小鼠,行Luxol fast blue染色分析髓鞘丢失情况,免疫荧光染色和TUNEL染色小鼠脊髓组织和体外细胞实验分析Mdivi-1髓鞘保护机制。结果:与DMSO模型组比较,Mdivi-1处理明显减少EAE小鼠脊髓组织白质区髓鞘丢失,减少少突胶质细胞凋亡及线粒体凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、caspase-9、cytochrome C和Bax的表达;体外MO3.13少突胶质细胞培养实验发现,Mdivi-1可以明显阻止星形孢菌素(staurosporine)处理诱导的线粒体膜电位去极化,减轻细胞损伤,增强细胞活力。结论:Mdivi-1可能通过抑制少突胶质细胞线粒体相关凋亡信号通路发挥髓鞘保护作用。

依托咪酯通过下调含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2表达抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨依托咪酯(ETO)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖和凋亡的影响及含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)在其中发挥的作用机制。方法分别采用0、1、2和3 mg/L的ETO处理人正常肺上皮细胞系BESA-2B和人NSCLC细胞系A549,细胞计数试剂盒法检测细胞活力;将A549细胞随机分为对照组、ETO(3 mg/L)组、ETO+NC组和ETO+WWP2-OE组,后2组分别于ETO处理后转染空载体pcDNA3.1-NC或WWP2过表达载体pcDNA3.1-WWP2,集落形成试验检测细胞增殖能力;TUNEL染色检测细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞中WWP2的mRNA表达;STITCH数据库选择与ETO直接相互作用的蛋白质;蛋白质印迹法检测各组细胞中WWP2、增殖、凋亡和磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路相关蛋白表达。结果ETO以剂量依赖性方式显著降低A549细胞活力(F=147.923,P<0.001);而对正常肺上皮BESA-2B细胞活力无影响(F=1.427,P=0.126)。不同浓度(0、1、2、3 mg/L)ETO处理A549细胞后,集落形成数量逐渐减少[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(898±38)、(785±48)、(635±36)、(388±20)个],细胞凋亡率逐渐升高[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(2.23±0.65)%、(7.63±0.35)%、(13.24±0.47)%、(18.93±0.36)%],呈剂量依赖性(F=218.732、352.786,均P<0.001)。STITCH数据库预测ETO可通过上调WWP2蛋白表达和下调PTEN蛋白表达与WWP2和PTEN相互作用。与对照组相比,ETO组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达降低,集落形成数量减少,细胞凋亡率升高,增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞增殖抗原Ki67、B淋巴细胞瘤基因2(Bcl-2)和PTEN蛋白表达降低,Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)蛋白表达升高,磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K和磷酸化Akt(p-Akt)/Akt比值降低(均P<0.01);与ETO+NC组比较,ETO+WWP2-OE组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达升高,集落形成数量增多,细胞凋亡率降低,PCNA、Ki67、Bcl-2和PTEN蛋白表达增多,Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达减少,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值升高(均P<0.01)。结论ETO可抑制A549细胞增殖并促进细胞凋亡,其作用机制可能与调控WWP2的下调和PTEN/PI3K/Akt通路的激活有关。

G蛋白偶联胆汁酸受体1通过抑制内质网应激减轻内皮素-1介导的乳鼠心肌细胞凋亡

目的观察G蛋白偶联胆汁酸受体1(G protein-coupled bile acid receptor 1,TGR5)被激活后对内皮素-1(endothelin-1,ET-1)介导的心肌细胞凋亡的作用,并探讨其机制。方法首先分对照组和ET-1组,ET-1浓度分别为10-6、10-7、10-8 mmol/L,分别培养12、24、36、48 h,流式细胞术检测各组各时段凋亡率。选择凋亡率较高的ET-1浓度及时间,进行后续实验。后续实验分为对照组、ET-1组、TGR5激动组、TGR5表达抑制组、TGR5空病毒组,流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡率,CCK-8测心肌细胞存活率,RT-PCR检测TGR5mRNA,Western blot检测TGR5、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terminal protein kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)及门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(casepase-12)表达。结果ET-1在10^(-8)~10^(-6) mmol/L的浓度范围呈浓度依赖性,48 h内呈时间依赖性介导心肌细胞凋亡(P<0.05)。后续实验发现激活TGR5后,相较于ET-1组,心肌细胞凋亡率下降,心肌细胞存活率提高,且CHOP、p-JNK、Caspase12蛋白表达受到抑制(P<0.05)。而抑制TGR5表达后可阻断TGR5对心肌细胞凋亡的抑制作用,降低心肌细胞存活率,CHOP、p-JNK、Caspase12蛋白表达增加(P<0.05)。结论ET-1可介导心肌细胞凋亡,其机制可能与内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)过度激活有关,而TGR5可能通过抑制ERS,拮抗ET-1对心肌细胞介导的凋亡作用。

机械应力调控血管平滑肌细胞的凋亡

背景:随着生物力学的发展,其在心血管疾病中的研究也日益广泛,通过研究血管的力学特性可以有效地揭示动脉粥样硬化、再狭窄等心血管疾病的发病机制,开发心血管疾病治疗的新思路和新方法。目的:综述机械应力刺激对血管平滑肌细胞凋亡的研究现状,寻找临床治疗潜在靶分子和信号通路,以期改善临床动脉粥样硬化及再狭窄等心血管疾病的临床治疗效果。方法:检索1992年1月至2023年5月在中国知网、PubMed及ScienceDirect数据库收录的文献。中文检索词为“血管平滑肌细胞,机械应力,剪切力,牵张力,凋亡”;英文检索词为“vascular smooth muscle cell,mechanical stress,shear stress,stretch stress,apoptosis”,最终纳入63篇文献进行综述分析。结果与结论:①血管平滑肌细胞的生理性和病理性凋亡都是为了适应血管力学变化而发生的适应性重构。不同部位的平滑肌细胞承受不同的力学刺激,其发病机制也不同。②低剪切力、生理剪切力和高剪切力可通过直接与平滑肌细胞表面分子、受体及蛋白等作用调控凋亡信号分子和抑制增殖实现对血管平滑肌细胞凋亡的调控,该部分未对促进增殖的研究进行综述。③低牵张力、生理牵张力和高牵张力可导致平滑肌细胞凋亡,但仍存在争议。平滑肌表面存在多种力学感受分子(如整合素及受体络氨酸激酶等)可以将力学信号转导为细胞内的化学信号(如Hippo通路),启动平滑肌细胞的凋亡信号,调控平滑肌细胞的凋亡。④总之,不同力学刺激通过多种信号分子,启动多个信号通路共同作用,调控平滑肌细胞的凋亡,例如剪切力主要通过刺激分泌前列腺素、转化生长因子等影响Fas/FasL、Akt通路;而牵张力主要通过Yes相关蛋白等调控YAP通路和Notch通路等。这些分子在不同的作用时间,或不同作用强度下可能发挥相反的双向作用,比如,小鼠血管平滑肌细胞受到10%生理牵张1 h时,其增殖增加;然而,人的血管平滑肌细胞牵张12 h后可以减少其增殖。临床可以通过寻找其关键作用时间点干扰力学转导关键分子,达到预防和治疗临床心血管疾病的目的。

三联体基序包含蛋白28在胃癌组织中的表达及其对胃癌HGC-27细胞侵袭、迁移、增殖和硼替佐米诱导的细胞凋亡的影响

目的:探讨三联体基序包含蛋白28(TRIM28)在胃癌组织中的表达及其对胃癌HGC-27细胞侵袭、迁移、增殖和硼替佐米(BTZ)诱导的细胞凋亡的影响。方法:收集10例胃癌患者的癌组织和癌旁组织,采用免疫组化和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测TRIM28阳性率及mRNA的表达水平。采用RNA干扰技术敲低人胃癌细胞株HGC-27中的TRIM28表达,采用Transwell和划痕愈合实验探究敲低TRIM28表达对胃癌细胞的侵袭、迁移能力的影响,采用MTT法检测细胞增殖能力,采用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。结果:胃癌组织中TRIM28阳性率及其mRNA表达水平高于癌旁组织(均P<0.05)。敲低TRIM28表达可抑制胃癌细胞的侵袭和迁移能力。敲低TRIM28表达显著抑制了胃癌细胞的增殖能力,并显著增强了BTZ诱导的细胞凋亡。结论:TRIM28在胃癌组织过表达,且与胃癌HGC-27细胞的侵袭、迁移、增殖和凋亡有关,同时影响BTZ的抗肿瘤作用。

神经调节蛋白4对2型糖尿病小鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响

目的探讨神经调节蛋白4(Nrg4)对2型糖尿病小鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响。方法将C57小鼠分为对照(Vehicle)组、糖尿病(DM)组和Nrg4干预糖尿病小鼠(Nrg4)组。Nrg4组腹腔注射Nrg4重组蛋白(100μg/kg,3次/周),Vehicle组与DM组小鼠注射等量生理盐水,干预周期均为8周。实验结束后,TUNEL荧光染色检测主动脉内皮细胞凋亡,Western blot检测主动脉内皮组织凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Cleaved-caspase 3的表达。结果与Vehicle组相比,DM组主动脉内皮细胞凋亡率明显升高[(33.0±5.4)%vs.(20.5±3.0)%;P<0.05],促凋亡蛋白Bax与凋亡执行蛋白Cleaved-caspase 3表达明显增多,抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著减少(P<0.05);而Nrg4干预明显抑制糖尿病小鼠主动脉内皮细胞凋亡[(19.2±3.8)%vs.(33.0±5.4)%;P<0.05],降低Bax与Cleaved-caspase 3的表达并促进Bcl-2表达(P<0.05)。结论Nrg4干预能缓解2型糖尿病小鼠主动脉内皮细胞凋亡。

胰岛素样生长因子结合蛋白2对高血糖环境诱导人足细胞凋亡的影响及机制研究

背景糖尿病肾病患者日益增加,仍有患者在现有治疗中进展为终末期肾病,因此迫切需要新型治疗靶点。目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin like growth factor binding protein 2,IGFBP2)对高血糖环境诱导人足细胞凋亡的影响及机制。方法体外培养的人足细胞随机分为正常血糖(normal glucose,NG)组(5 mmol/L)以及高血糖(high glucose,HG)24 h组、HG 48 h组、HG 72 h组(30 mmol/L)。采用RT-qPCR法检测IGFBP2、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)mRNA表达水平,Western blot检测IGFBP2和Cleaved Caspase 3蛋白表达水平,以此确定后续实验HG处理的最佳时间点。将IGFBP2小干扰RNA转染进入足细胞并分为NG组、阴性对照干预组(NG-NC-siRNA)、IGFBP2敲低siRNA干预组(NG-IGFBP2-siRNA1、NG-IGFBP2-siRNA2、NG-IGFBP2-siRNA3),RT-qPCR检测IGFBP2 mRNA表达水平,选择敲低效率最高的IGFBP2-siRNA用于后续实验。根据实验内容将足细胞随机分为:(1)NG组和HG组;(2)NG组和NG+125 ng/mL rhIGFBP2组;(3)HG组和HG-IGFBP2-siRNA组。(1)(2)(3)均通过RT-qPCR检测TNF-α和ICAM-1 mRNA表达水平,JC-1染色法检测线粒体膜电位,共聚焦显微镜检测线粒体超氧化物和活性氧荧光强度,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果随HG处理时间增加,RT-qPCR结果显示IGFBP2、TNF-α和ICAM-1 mRNA水平随时间升高,Western blot结果显示IGFBP2和Cleaved Caspase 3蛋白水平随时间升高。与NG组比较,RT-qPCR结果显示IGFBP2、TNF-α和ICAM-1均在HG 72 h时mRNA水平最高(P<0.05),Western blot结果显示IGFBP2在HG 72 h时和Cleaved Caspase 3在HG 48 h时蛋白水平最高(P<0.05),据此选72 h为后续实验诱导时间点。RT-qPCR检测结果显示,与NG组相比,阴性对照干预组mRNA表达无统计学差异(P>0.05),NG-IGFBP2-siRNA2组IGFBP2 mRNA表达水平最低(P<0.05),敲除效率最高,因此选择IGFBP2-siRNA2进行后续实验。与NG组相比较,HG组线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均增强(P<0.05)。与NG组相比较,NG+125 ng/mL rhIGFBP2组的TNF-α和ICAM-1 mRNA水平、线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均升高(P<0.05)。与HG组相比较,HG-IGFBP2-siRNA组的TNF-α和ICAM-1 mRNA表达水平、线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均降低(P<0.05)。结论敲除IGFBP2后通过减弱高血糖处理下的线粒体功能紊乱和氧化应激降低人足细胞凋亡,因此抑制IGFBP2的表达有望成为糖尿病肾病的潜在治疗策略。

微小核糖核酸-136-5p靶向Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1调控胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的机制

目的:探讨微小核糖核酸(miR-136-5p)靶向Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1(ROCK1)对胃癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。方法:胃癌MKN-45细胞购自美国细胞培养物收藏中心,分为胃癌MKN-45细胞组、miR-NC组、miR-136-5p-mimics组(过表达组)、miR-136-5p-inhibitor组(低表达组),测定各组细胞增殖水平、单克隆形成数目、凋亡率、侵袭水平以及miR-136-5p、ROCK1 mRNA和蛋白水平,细胞增殖水平、凋亡率等计量资料用单因素方差分析及LSD-t检验。结果:miR-136-5p-mimics组吸光度(A)值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数、ROCK1 mRNA和蛋白表达水平低于胃癌MKN-45细胞组[0.42±0.02比0.75±0.03、(42.25±7.20)%比(78.19±6.08)%、239.89±35.27比619.33±89.20、(293.85±95.28)个比(693.85±184.74)个、2.04±0.24比3.85±0.25、0.38±0.07比0.97±0.13]和miR-NC组[0.42±0.02比0.73±0.03)、(42.25±7.20)%比(76.59±7.30)%、239.89±35.27比614.89±75.33、(293.85±95.28)个比(702.28±111.52)个、2.04±0.24比3.90±0.23、0.38±0.07比0.85±0.16],而细胞凋亡率、miR-136-5p表达水平高于胃癌MKN-45细胞组[(7.14±1.11)%比(3.68±1.02)%、5.68±0.37比3.17±0.33]和miR-NC组[(7.14±1.11)%比(3.46±1.04)%、5.68±0.37比3.15±0.36,t=10.258、15.941、28.614、30.051、17.685、22.973、10.107、15.425、26.237、28.336、16.811、21.392、15.945、14.528、17.846、14.403,P<0.05]。miR-136-5p-inhibitor组A值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数、ROCK1 mRNA和蛋白表达水平高于胃癌MKN-45细胞组[0.93±0.03比0.75±0.03、(86.58±6.36)%比(78.19±6.08)%,1062.29±102.78比619.33±89.20、(1917.34±425.35)个比(693.85±184.74)个、4.63±0.28比3.85±0.25、1.82±0.18比0.97±0.13]和miR-NC组[0.93±0.03比0.73±0.03、(86.58±6.36)%比(76.59±7.30)%,1062.29±102.78比614.89±75.33、(1917.34±425.35)个比(702.28±111.52)个、4.63±0.28比3.90±0.23、1.82±0.18比0.85±0.16],细胞凋亡率、miR-136-5p表达水平低于胃癌MKN-45细胞组[(1.12±0.79)%比(3.68±1.02)%、1.42±0.38比3.17±0.33]和miR-NC组[(1.12±0.79)%比(3.46±1.04)%、1.42±0.38比3.15±0.36,t=7.102、5.094、21.841、30.816、14.691、13.487、7.210、5.339、22.083、31.294、15.112、13.625、6.369、11.207、7.841、12.564,P<0.05]。miR-136-5p-inhibitor组A值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数、ROCK1 mRNA和蛋白表达水平高于miR-136-5p-mimics组,细胞凋亡率、miR-136-5p表达水平低于miR-136-5p-mimics组(t=15.814、19.336、32.519、38.946、21.058、25.427、11.742、10.088,P<0.05)。结论:miR-136-5p上调可以通过ROCK1信号通路抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡。

针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB/激活蛋白-1信号通路的影响

目的探讨针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)信号通路的影响。方法将36只SD大鼠随机分为针刺组、模型组和对照组,各12只。采用胶原酶加肝素联合注射大鼠尾状核制备脑心综合征大鼠模型,对照组给予等剂量生理盐水向大鼠尾状核注入,手术操作过程同模型组。模型组和假手术组均不予针刺;针刺组选心俞穴、内关穴、风府穴和水沟穴,每日针刺1次,连续3天。采用原位末端凋亡(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)法测定脑组织细胞凋亡情况;神经功能采用Zea-Longa法评估;运用酶联免疫法测定白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平;采用Western Blot法测定MAPK、NF-κB、AP-1蛋白表达。结果模型组和针刺组大鼠脑组织细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠脑组织AI低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠神经行为评分高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠神经行为评分低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值低于模型组(P<0.05)。结论脑心综合征大鼠采用针刺可减轻大鼠脑组织细胞凋亡,减轻大鼠炎症因子,且可下调MAPK/NF-κB/AP-1信号通路表达。