转反义蜡质基因‘湘晴’及其杂交稻米的直链淀粉含量研究

利用根癌农杆菌介导将反义蜡质基因(anti-Waxy)导入三系恢复系湘晴水稻获得转基因植株.从T1代外源基因呈单拷贝整合的转基因湘晴水稻中选取3个稻米直链淀粉含量降低较明显的单株继续种植得到纯合后代.以纯合转基因植株及湘晴水稻(对照)为恢复系分别与寒丰不育系杂交,获得4组杂交稻后代(F2).3个T3代纯合转基因湘晴水稻糙米(T4)直链淀粉含量分别为14.42%、13.96%和14.72%,对照为16.04%;3组由转基因湘晴水稻为父本杂交制种后代(F2)糙米直链淀粉含量分别为14.53%、13.77%和14.64%,对照杂交稻(F2)为16.22%.研究表明,导入湘晴水稻中的反义蜡质基因不仅能够降低湘晴稻米直链淀粉含量,还能够进一步抑制杂交后代的稻米直链淀粉合成.

导入反义蜡质基因改良水稻稻米的食味品质和营养品质

经PCR、Southernblot和稻米GUS检测,蜡质基因反义片段与gus构成的融合基因已整合到8株水稻基因组中,并能正确表达。通过稻米GUS染色追踪分析获得转反义蜡质基因纯合后代。将转基因植株的稻米送农业部稻米及制品质量监督检验测试中心进行糙米蛋白质含量和直链淀粉含量测定。结果显示:(1)在转反义蜡质基因纯合的超2-10粳稻后代中,大多数单株糙米在直链淀粉含量降低的同时,蛋白质含量有不同程度提高,糙米蛋白质含量和直链淀粉含量呈显著负相关关系;(2)对照糙米直链淀粉平均含量和糙米蛋白质平均含量分别为13.4%和9.5%。在转基因植株中,稻米直链淀粉含量最低的为11.4%,而蛋白质含量也相对最高,为13.5%。本试验结果表明在水稻中导入反义蜡质基因不仅能够降低水稻稻米的直链淀粉含量,还有可能提高水稻稻米的蛋白质含量。

共转化获得无抗性标记的转反义蜡质基因籼稻

【目的】利用转基因技术将反义蜡质基因导入籼稻成熟胚愈伤组织中,改良籼稻稻米直链淀粉含量。【方法】用根癌农杆菌介导的方法将p13W8质粒(含反义蜡质基因)和pCAMBIA1300质粒(含抗潮霉素抗性基因)对2个籼稻品种的成熟胚愈伤组织进行遗传共转化。【结果】供试材料愈伤组织继代培养18～24d后具有较高的转化频率和分化频率,可作为共转化的良好受体;抗性愈伤组织PCR检测结果表明,抗潮霉素抗性基因的阳性检测率为97.6%,反义蜡质基因的阳性检测率为27.1%。在46株转基因潮霉素抗性植株中,反义蜡质基因阳性株为5株,占转基因植株的10.9%。经PCR检测,发现上述4个株系T1群体中发生抗潮霉素抗性基因和反义蜡质基因片段的分离,从286个T1单株中筛选到了39个单株只带反义蜡质基因片段,而无潮霉素抗性基因的转基因植株,占T1单株总数的13.6%。部分转反义蜡质基因植株种子的直链淀粉含量有不同程度的降低。【结论】通过农杆菌介导的遗传共转化方法,将反义蜡质基因Waxy导入籼稻成熟胚愈伤组织,获得了直链淀粉含量明显降低的仅含反义蜡质基因籼稻株系。

籼稻转反义蜡质基因后代的直链淀粉含量测定和纯系选育

通过根癌农杆菌介导将反义蜡质基因导入籼型雄性不育保持系龙特甫B中,获得30个PCR检测为阳性的转基因植株,其中,28个为Southern检测阳性。T_1种子直链淀粉含量测定结果表明,有21个转基因植株比龙特甫B明显下降,下降幅度为3%-13%,并在部分转基因植株的种子中观察到蜡质状籽粒;对6个转基因植株进行了不同世代的直链淀粉含量测定,在L3和L5的T_4代中,选择到直链淀粉含量分别为15.9%和8.4%的纯合株系,经凝胶电泳测定,W_x蛋白量明显降低,并与直链淀粉含量下降表现一致。以L3-1-1-1(15.9%)和L5-8-2-1(8.4%)纯合株系为亲本,分别与龙特甫A进行成对杂交和回交,并测定了F_1和B_1F_1种子直链淀粉含量,以L3-1-1-1作亲本的F_1为21.4%,B_1F_1为17.1%;以L5-8-2-1作亲本的F_1为13.6%,B-1F-1为9.3%,结果表明:在不育系的转育过程中,以中低直链淀粉含量的转基因纯合株系为亲本,能有效降低F_1和B_1F_1的种子直链淀粉含量。

农杆菌介导法将反义蜡质基因转入杂交稻亲本

通过农杆菌介导法将反义蜡质基因导入特青(OryzasativaL.subsp.indica)和广粳1号(OryzasativaL.subsp.japonica)这两个杂交稻亲本的愈伤组织中,获得了经PCR检测证明外源基因已整合进植物基因组中的再生植株,其中含潮霉素抗性基因的植株有6株,但仅有2株能够扩增出反义蜡质基因的特异条带,其原因可能是在转基因植株中出现了基因丢失或沉默现象。试验表明,粳型稻广粳1号的不同外植体(成熟胚、幼胚、幼穗、花药)的愈伤诱导率比特青的高,且随着继代时间的延长,不同基因型水稻诱导的愈伤之间的转化率存在着极显著性差异(P<0.01);经过转染的水稻愈伤在一定的筛选压力下会出现“逃逸”现象,抗性筛选后成活愈伤PCR检测发现广粳1号和特青的愈伤转化率只有44.4%和29.4%;不同凝固剂对愈伤诱导的质量有着明显的影响,植物凝胶作凝固剂比琼脂作凝固剂时的愈伤褐化率低。

根癌农杆菌介导反义蜡质基因的水稻遗传转化

通过根癌农杆菌介导法 ,将水稻反义蜡质基因导入 6个水稻品种 (系 )幼胚的愈伤组织。这些愈伤组织经连续两次2 5～ 5 0 mg/L潮霉素抗性筛选 ,获得抗性愈伤组织的转化频率为 3 0 .75 %～ 5 9.0 9% ,经分化培养 ,不同品种的绿苗转化频率分别为 3 .85 %～ 8.97%。分化成苗的植株经 GUS检测 ,80 %以上的植株叶片呈阳性反应 ,显示蓝色。部分呈阴性反应的植株经 PCR检测 ,也能扩增出外源基因相应的 DNA片断 。

导入反义蜡质基因降低两系不育系稻米直链淀粉含量

为了提高两系不育系261S水稻的选配范围,研究利用根癌农杆茵介导法将蜡质基因反义片段导入261S未成熟种子形成的愈伤组织,经抗性筛选及PCR检测获得46棵T_0代转基因植株.采用GUS染色追踪分析获得转反义蜡质基因纯合的T_2代转基因植株.10个转基因植株糙米经直链淀粉含量分析显示:未转基因261S对照水稻糙米直链淀粉平均含量为18.54%,大部分转基因后代糙米直链淀粉含量有不同程度的降低,降低程度最大的转基因后代糙米直链淀粉平均含量为13.55%,比对照降低26.91%.开展本研究可为两系杂交稻优质育种奠定基础.

转反义蜡质基因水稻亲本后代性状分析

以单质粒转化的粳稻广粳一号和双质粒共转化的籼稻01早5202所获得的转反义蜡质基因水稻后代为供试材料,通过潮霉素抗性、PCR检测等手段分析了外源基因的遗传分离特性,同时,还分析了转基因材料的直链淀粉含量、waxy蛋白含量的变化特性。结果表明,无论是采用标记基因(hpt)与目的基因(Anti-sense waxy)连锁的单质粒转化,还是采用双质粒共转化,其供试的后代植株材料都发生了外源基因分离现象,且转基因植株材料的直链淀粉含量都有所下降,有些单株的直链淀粉含量已降至10%(质量百分比)以下,远低于对照(其直链淀粉含量为22.04%);SDS-PAGE检测结果显示,供试的转基因材料的waxy蛋白的含量与对应的直链淀粉含量呈正相关性。

反义蜡质基因质粒pW XAB的构建

Waxy protein is negatively correlated to noodles making quality.In order to inhibiting the expression of waxy gene and improving noodles quality,a plasmid including antisense waxy gene and Bar gene is constructed.Its size is about 11.7kb.

根癌农杆菌介导反义蜡质基因获得水稻植株研究初报

采用根癌农杆菌介导法,将水稻反义蜡质基因导入寒地4个水稻品种(系)成熟胚的愈伤组织.这些愈伤组织经连续2次25～50 mg/L潮霉素抗性筛选,获得抗性愈伤组织的转化频率为12.15%～25.95%,经分化培养,不同品种的绿苗转化频率分别为2.49%～4.43%.分化成苗的植株经GUS检测,80%以上的植株叶片呈阳性反应,显示兰色.经PCR检测,也能扩增出外源基因相应的DNA片断,证明外源基因已整合到转基因植株中.

转反义蜡质基因纯合株系间直链淀粉含量与RVA谱关系分析

【目的】排除以往水稻亚种或品种间RVA谱分析时存在着的遗传背景差异,分析转反义蜡质基因不同直链淀粉含量纯合株系间RVA各特征值的差异,更清楚地揭示直链淀粉含量与RVA谱特征值的关系。【方法】采用根癌农杆菌介导共转化和花药培养相结合的方法,培育含有反义蜡质基因的花培纯系,并对各株系进行直链淀粉含量和RVA谱测定和分析,通过比较RVA谱曲线图形及RVA谱特征值的显著性测定,分析相同遗传背景条件下直链淀粉含量对各RVA谱特征值的作用。【结果】在武运粳7号转基因后代中,获得了只含反义蜡质基因、不含潮霉素抗性标记的花培株系77个,经T1H1和T1H2二代直链淀粉含量测定,有19个株系的直链淀粉含量接近对照(对照16.0%);有50个株系直链淀粉含量比对照下降1%～5%,其中,直链淀粉含量在11.0%～13.9%有30个株系;另外,有8个株系的籽粒为蜡质状,直链淀粉含量降至3.1%～4.0%。不同直链淀粉含量纯系间RVA谱分析发现存在二种RVA谱曲线图形,直链淀粉含量在3.1%～4.0%株系明显不同其它株系,也不同于常规糯稻;对RVA谱曲线图形相同、直链淀粉含量不同的株系进行分类比较,低直链淀粉含量株系的RVA谱曲线最终表现为曲线逐步上升,但没有超越第1个峰值。对不同直链淀粉含量株系类群的各RVA谱特征值进行显著性测定,3.1%～4.0%株系群有5个特征值与其它二个株系群存在极显著差异;11.0%～13.5%株系群有3个特征值与对照16.0%组存在极显著差异;直链淀粉含量与RVA谱各特征值之间优化数学模型显示:峰值时间和消减值与直链淀粉含量关系较为密切。【结论】导入反义蜡质基因,能导致直链淀粉含量降低;通过花药培养能快速获得纯合株系;直链淀粉含量差异不仅影响到各RVA谱特征值,而且还造成RVA谱曲线不同。

反义蜡质基因不同整合位点对降低稻米直链淀粉含量的影响及整合位点分析

本研究以含有反义蜡质基因双拷贝整合转化子Sh3为材料,通过后代分离获得由单拷贝及仍然呈双拷贝整合转基因植株后,采用TAIL-PCR对这些后代进行T-DNA整合位点分析。结果显示,两个外源基因分别整合在Sh3转化子基因组中第3号染色体9127056～91266603bp处和第4号染色体9977226～9976939bp处。检测由Sh3转化子后代分离获得外源基因单拷贝以及双拷贝整合植株糙米直链淀粉含量,结果显示,非转基因对照糙米直链淀粉平均含量为12.83%,外源基因整合在第3和第4染色体上的单拷贝植株糙米直链淀粉平均含量分别为5.31%和11.83%,双拷贝整合植株糙米直链淀粉含量平均为3.8%。通过本研究不仅明确了反义蜡质基因不同整合位点对于降低糙米直链淀粉含量程度有不同的影响,同时也获得了一个能够使转基因水稻糙米直链淀粉含量降低较明显的位点。

利用安全性转基因技术导入反义蜡质基因降低稻米直链淀粉含量

利用安全性转基因技术中的共转化法, 将分别含有 p13W4 双元载体(含有潮霉素抗性基因、gus报告基因以及反义蜡质基因片段)和 p13W8双元载体(无潮霉素抗性基因和 gus 报告基因, 只含有反义蜡质基因片段)的根癌农杆菌以 1︰9 的比例混合导入超 2-10 高产水稻新品系中, 获得 34 棵转基因植株.PCR 分析转基因 T0 代植株, 结果显示, 有 15 株是共转化植株, 共转化率为 44.1%. 利用 p13W4 双元载体上的 gus 报告基因从 T1代种子中淘汰具有报告基因及抗性标记基因的转基因后代, 再利用 PCR 检测从 T1代植株中获得只有反义蜡质基因的植株. Southern blot杂交分析证实, p13W8双元载体 T-DNA已整合进入无抗性标记及报告基因的转基因后代基因组中. T2代成熟种子直链淀粉含量分析显示, 转基因植株糙米直链淀粉含量比对照有不同程度的下降, 幅度最大的比对照降低 28.61%. 由于获得的转基因后代只有目的基因而无抗性选择标记基因和报告基因, 而且水稻中的稻米直链淀粉含量已降低, 它们既可被用于筛选软米材料, 也可视为是能够用于其他水稻稻米食味品质改良的水稻新资源.

通过根癌农杆菌介导的共转化获得具有蜡质基因反义片段的转基因水稻

在构建剔除潮霉素抗性基因的反义蜡质基因重组质粒p1 3W8的基础上 ,用分别携带p1 3W8质粒和有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1 3 0 0质粒的根癌农杆菌 ,在不同处理条件下对粳稻 3个品种进行共转化。试验结果显示 ,共感染混合液中pCAMBIA1 3 0 0菌液比例高 ,抗性愈伤组织的转化频率也较高 ;抗性愈伤组织的PCR检测结果表明 ,潮霉素抗性基因的阳性检测率为 98% ,反义蜡质基因的阳性检测率为68%。在 1 0 5株转基因植株中 ,反义蜡质基因阳性株为 3 0株 ,占转基因植株的 2 8.6%。乙酰丁香酮处理组的平均转化频率略高于未处理组 ;在乙酰丁香酮的各种处理中 ,直接浸泡愈伤组织的转化频率稍高于其它处理方式。

转反义 Wx基因糯稻的显性遗传及对稻米粒重的效应分析

利用直链淀粉含量下降至 2 %左右的 3个转反义Wx基因糯稻为研究材料 ,较为系统地分析了转基因糯稻的遗传及其直链淀粉含量下降后对于稻米粒重的影响。结果表明由转基因技术获得的糯性性状与其它转基因性状一样 ,表现为显性遗传 ,这与一般的糯性变异不同。导入反义Wx基因使直链淀粉含量从 17%下降至糯稻水平时 ,其稻米粒重相应降低 6 %～ 8% ,且下降幅度与直链淀粉含量的下降幅度呈显著正相关。小区试验结果表明 ,由此获得的转基因糯稻仍具有原受体亲本的高产潜力 ,利用转基因技术培育既高产又优质的水稻品种 。

根癌农杆菌介导的水稻转化系统的优化及转反义Wx基因植株的获得

以具不同直链淀粉含量的籼粳稻品种为受体材料 ,试验了适宜于根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织诱导培养基及其诱导培养的时间。结果表明 ,一种基于 MS基本培养基的商品培养基较适合作为籼粳稻幼胚愈伤组织的诱导培养基 ;对于籼型杂交稻亲本协青早 B,转化前幼胚较适合的愈伤组织诱导培养天数为 8d左右。在此基础上 ,将反义蜡质 (Wx)基因分别导入上述受体亲本中 ,获得了一批转基因水稻植株。PCR和 Southern杂交分析表明反义 Wx基因已经整合进了转基因水稻的基因组中。遗传分析表明外源基因在转基因水稻后代中的分离符合 3∶

水稻蜡质基因及其利用研究进展

简要介绍了水稻蜡质基因的等位基因位点及其表达特性,并从蜡质基因第1内含子核苷酸和蜡质基因剪切方式以及蜡质基因相关的顺式作用元件与反式作用因子等方面阐述了水稻蜡质基因表达调控.还概述了水稻蜡质基因的分子标记辅助选育方面的研究.从近年来的报道显示,利用反义RNA技术抑制水稻内源蜡质蛋白的表达是目前蜡质基因应用研究的主要方向.关于蜡质基因的研究,在其它作物中也都有报道.

反义Waxy基因共转化籼型杂交稻亲本的初步研究

以籼型杂交稻亲本II32B为供试材料,对根癌农杆菌共转化过程中影响转化效率的因素进行了研究。结果表明:在诱导培养基和分化培养基中附加NAA、KT和6-BA的激素配比可以改进愈伤组织质量,对愈伤组织的形成和苗的分化起决定作用;农杆菌OD600为0.8,侵染时间为10 min是II32B合适的转化参数;潮霉素浓度为30 mg/L是理想的筛选浓度;部分植株经PCR检测为阳性,证明外源目的基因已经整合到转基因水稻的基因组中,从而建立适合于供试水稻材料的遗传转化体系。

反义Waxy基因转化籼稻9311的初步研究

以籼稻品种9311为材料,研究了不同诱导培养基对籼稻9311的诱导率,以及农杆菌浓度、浸染时间和干燥处理时间对抗性愈伤率的影响,进而采用农杆菌介导的共转化方法将含有反义Waxy基因的p13W8质粒和含有潮霉素抗性标记基因的p1300质粒同时转化受体材料.结果表明:籼稻9311成熟胚在含质量浓度为3.0mg/L的2,4-D的N6基本培养基上具有较高的愈伤组织诱导率,且愈伤的胚性性状良好;愈伤组织在OD600值为0.6的农杆菌菌液中浸染10min、干燥1.5～2.0h处理后能够获得较多的抗性愈伤组织;对转化水稻的再生植株进行PCR检测表明,反义Waxy基因已整合进T0代水稻基因组中.

通过共转化和花药培养快速获得直链淀粉含量降低且无抗性标记的转基因水稻

用根癌农杆菌共转化的方法将p13W8质粒(含反义蜡质基因)和pCAMBIA1300质粒(含潮霉素抗性基因)导入水稻。经PCR检测,发现在29个T1群体中发生抗潮霉素抗性基因和反义蜡质基因的分离;从1264个T1单株中筛选到183个只带反义蜡质基因片段的转基因植株。选择了4个直链淀粉含量降低的T1单株进行花药培养,获得正常结实的花培苗34株;经PCR检测,有23株为只含反义蜡质基因而无潮霉素抗性基因的植株。从转化到获得直链淀粉含量降低、遗传稳定的转基因植株仅用了一年半时间。