脂质体-c-erbB-2反义寡核苷酸转染对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤形成的抑制作用研究

目的 探讨经脂质体—硫代磷酸化修饰的c erbB 2反义寡脱氧核苷酸 (ASODN )作用后的卵巢上皮癌细胞株SKOV3 在裸鼠皮下的成瘤能力。方法 利用脂质体将经硫代磷酸化修饰的寡核苷酸导入SKOV3 细胞内 ,然后将这种被转染的细胞接种于裸鼠皮下 ,观察肿瘤体积的变化 ,并计算抑瘤率。结果 经脂质体 c erbB 2ASODN作用后的卵巢上皮癌细胞在裸鼠皮下成瘤能力降低 ,最大抑瘤率达 4 0 .0 %(P <0 .0 5 )。首次出现目检可见肿瘤的平均时间延长为 9.6天 (P <0 .0 5 )。结论 c erbB 2癌基因的反义调控能降低卵巢上皮癌细胞的成瘤能力 ,抑制肿瘤生长 ,在卵巢上皮癌的基因治疗中有一定价值。

BTEB2反义基因转染对大鼠颈动脉球囊损伤后内皮修复的影响

目的构建反义基本转录元件结合蛋白2(BTEB2)重组腺病毒载体,并研究BTEB2反义RNA对动脉损伤后内皮修复的影响。方法通过RTPCR从培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)中制备BTEB2cDNA,将其反向克隆至腺病毒载体,构建反义BTEB2重组腺病毒;用重组腺病毒局部转染球囊损伤的大鼠颈动脉,观察反义BTEB2基因转染对BTEB2蛋白表达及损伤内皮修复的影响。结果构建的BTEB2反义重组腺病毒经鉴定正确,其滴度为5×1010pfumL;反义BTEB2重组腺病毒转染可显著抑制BTEB2蛋白表达,明显促进内皮的修复,改善损伤动脉的内皮依赖性舒张功能。结论成功构建了反义BTEB2重组腺病毒载体。BTEB2反义基因转染可显著促进大鼠颈动脉球囊损伤后的内皮修复。

转染反义Bcl-2对柔红霉素诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响

目的 :观察转染反义Bcl 2对柔红霉素诱导人视网膜色素上皮细胞 (RPE)凋亡的影响 .方法 :用Annexin V fluo ,琼脂糖凝胶电泳 ,TUNEL分别观察柔红霉素诱导正常RPE与转染反义Bcl 2的RPE的凋亡作用 .结果 :Annex in V fluo法在 4h即可检测到凋亡细胞膜的变化 ,琼脂糖凝胶电泳在 36h可检测到确切的梯状带纹 ,1 80 μg·L-1 柔红霉素作用 72h转染组与正常组凋亡指数分别为 0 .5 9和 0 .4 5 (P <0 .0 1 ) .结论 :转染反义Bcl 2可增加柔红霉素诱导的RPE凋亡的敏感性 .

RPL23编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞

目的 扩增人核糖体蛋白 L 2 3(RPL 2 3)编码基因序列 ,构建其正、反义真核表达载体 ,分别转染胃癌细胞SGC790 1及胃癌长春新碱耐药细胞 SGC790 1 /VCR,以进一步研究 RPL2 3基因与胃癌多药耐药的关系 .方法 按文献报道的 RPL 2 3核苷酸序列设计合成 PCR引物 ,利用总 RNA抽取试剂盒从人胃癌长春新碱耐药细胞 SGC790 1 /VCR中提取细胞总 RNA,反转录合成 c DNA,再用 PCR方法扩增目的基因序列 .PCR产物经 DNA序列测定证实后 ,通过双酶切 ,将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体 pc DNA3.1 (+)中 ,酶切电泳鉴定 .采用脂质体介导的方法将 pc DNA3.1 (+) - RPL 2 3转染 SGC790 1细胞 ,pc DNA3.1(+) - an RPL2 3转染 SGC790 1 /VCR细胞 ,经 G41 8筛选后 ,随机挑选细胞克隆 .通过斑点杂交检测正、反义转染后 RPL2 3m RNA表达水平的变化 .结果 应用 RT- PCR反应扩增获得大小约 0 .5 kb的特异性片段 .经 DNA序列分析 ,证实与文献报道的人 RPL2 3编码区序列一致 .重组正义真核表达载体 pc DNA3.1 (+) - RPL2 3双酶切产生大小约 5.4kb,0 .5kb的片段 ;重组反义真核表达载体 pc DNA3.1 (+) - an RPL2 3双酶切产生大小约 5.4kb,0 .5kb的片段 ,均与预期结果相符 .转染细胞经筛选后 ,随机挑选 。

转染反义磷脂酶A_2寡核苷酸抑制LPS诱导Hela细胞分泌IL-1β和IL-6

目的 :研究胞浆型磷脂酶A2 (cytosolicphospholipaseA2 ,cPLA2 ,85 kDPLA2 )在脂多糖诱导Hela细胞释放细胞因子IL 1β、IL 6的信号机制中的作用。 方法 :①利用脂质体将cPLA2 的反义寡核苷酸转染入Hela细胞 ,通过聚合酶链式反应(RT PCR)及Western杂交印迹分析检验胞浆中cPLA2 水平的变化 ;②用放免方法检测不同时间培养上清中的IL 1β、IL 6浓度。结果 :①转染后cPLA2 的蛋白表达明显减少 ,但mRNA水平未见显著改变 ;②Hela细胞释放IL 1β、IL 6随cPLA2 反义寡核苷酸浓度的增加而减少。结论 :cPLA2 在LPS刺激的Hela细胞释放炎性细胞因子IL 1β、IL 6的过程中可能发挥重要的信号传递作用。

c-jun反义基因转染与缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞凋亡关系的研究

目的 探讨c jun反义基因转染与缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞凋亡的关系。方法 烧伤血清采自 3 0 %TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠 ;采用含 1%O2 的混和气体造成缺氧模型 ;采用基因重组技术构建c jun反义基因重组体 ;用Li pofectaminekit介导心肌细胞转染 ;用核苷酸末端转移酶介导的dUTP末端标记法 (TUNEL)检测心肌细胞的凋亡情况 ,同时对凋亡心肌细胞进行计数并作统计学分析。结果 加入烧伤血清并造成缺氧 (下文称非转染组 )后 12h ,2 4h和 48h ,凋亡心肌细胞数 (每高倍视野均数 )分别为 ( 7 1± 0 842 ) ,( 2 8 4± 1 63 5 )和 ( 13 2± 1 5 2 5 ) ;转染c jun反义基因 (下文称转染组 )后 12h ,2 4h和 48h ,凋亡心肌细胞数分别为 ( 4 1± 0 716) ,( 12 3± 1 45 5 )和 ( 8 5± 1 3 41) ,两组比较差异有显著性 (P <0 0 1)。结论 c jun反义基因转染可以减轻缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞凋亡性损伤。

反义T-STAR基因转染降低肺腺癌A549细胞端粒酶活性

目的 通过反义技术抑制肺腺癌A5 49细胞T STAR (testes signaltransductionandactivatorofRNA)基因内源性表达,观察对细胞端粒酶活性的影响。方法 用阳性脂质体法将T STAR反义基因转染入A5 49细胞,用RT PCR及Westernblot方法检测转染细胞内源性T STAR基因mRNA和蛋白表达水平,并用PCR ELISA法检测细胞端粒酶活性改变。结果 反义基因可在mRNA及蛋白水平有效抑制肺腺癌A5 49T STAR基因的表达,同时明显降低细胞端粒酶活性。结论 肺腺癌A5 49细胞T STAR基因表达的抑制可能下调端粒酶活性。

高迁移率族蛋白框1反义核酸抑制人胰腺癌细胞系PCNA-1侵袭的研究

背景与目的:研究证明高迁移率族蛋白框1(highmobilitygroupbox1,HMGB1)在大多数未成熟及恶性肿瘤细胞中高表达,它与细胞增殖、侵袭、转移有密切关系。我们前期的研究证明HMGB1在胰腺癌组织中高表达并与肿瘤的侵袭及转移显著性相关。本研究的目的是观察HMGB1反义核酸对胰腺癌PCNA-1细胞体外侵袭能力的影响,并探讨其作用机制。方法:以脂质体介导方法将HMGB1反义表达载体转染胰腺癌细胞株PCNA-1,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测HMGB1、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase-2,-9,MMP-2,MMP-9)mRNA的表达,Westernblot法检测HMGB1蛋白表达,明胶酶谱法(gelatinzymography)检测MMP-2和MMP-9活性的变化,Boyden小室法检测PCNA-1的体外侵袭能力。结果:HMGB1反义核酸明显抑制PCNA-1细胞HMGB1mRNA和蛋白的表达。转染后,MMP-2及MMP-9mRNA表达和酶活性亦受到显著抑制(P<0.01)。另外,HMGB1反义核酸的导入显著减弱了胰腺癌细胞的跨膜侵袭能力(P<0.01)。结论:HMGB1在胰腺癌侵袭转移中,阻断HMGB1基因的表达,可能是阻抑胰腺癌转移的一种新策略。

反义技术封闭骨肉瘤细胞中Survivin基因表达的实验研究

目的:观测反义寡核苷酸(ASODN)抑制骨肉瘤细胞中Survivin基因表达的效应。方法:合成特异性靶向Survivin的ASODN,以不同浓度对骨肉瘤OS-732细胞进行转染,并设空白、正义(SODN)对照组进行比较。观察转染前后细胞生长状态,采用RT-PCR、Westernblot、免疫细胞化学技术检测各组细胞中SurvivinmRNA、蛋白表达水平;进一步将各组细胞接种于裸鼠,观测细胞成瘤情况。结果:与空白对照组、SODN组相比,转染ASODN组细胞数量减少,生长延缓,SurvivinmRNA和蛋白表达水平降低,裸鼠体内肿瘤发生时间延迟,瘤重显著小于对照组和SODN组。结论:ASODN能够特异性封闭骨肉瘤OS-732细胞中Survivin基因表达,抑制肿瘤细胞的存活与生长。

Par-4基因在PC12细胞缺氧后的表达及其反义寡核苷酸的抗凋亡作用

目的研究前列腺凋亡反应基因4(Par4)在PC12细胞缺氧后的表达及其反义寡核苷酸(ASODN)的抗凋亡作用。方法在正常或缺氧条件下培养PC12细胞,分组将不同浓度Par4反义寡核苷酸转染PC12细胞,吖啶橙/溴化乙锭荧光染色观察PC12细胞形态,流式细胞分析评价凋亡百分率。Westernblot测定Par4蛋白表达量,比色法检测Caspase3的酶活性。结果缺氧24h,PC12细胞中Par4蛋白表达量上调157.42±7.53,明显高于正常对照组10.51±3.36(P<0.01)。10μmol/L的Par4,ASODN使Par4蛋白降为31.79±3.09,明显低于缺氧组157.42±7.53(P<0.01)。Par4的ASODN抑制缺氧诱导的PC12细胞凋亡,10μmol/LASODN使细胞凋亡百分数降为(34.5±3.5)%,明显低于缺氧组的(69.3±5.7)%(P<0.05)。Par4的ASODN抑制缺氧诱导的PC12细胞中Caspase3的酶活性上调,10μmol/LASODN使其活性降为0.549±0.078,与缺氧组0.917±0.051相比,差别有显著性意义(P<0.05)。结论Par4基因可能参与了缺氧诱导的PC12细胞损害。Par4ASODN可拮抗缺氧诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与Caspase3酶活性下调有关。

转染反义VEGF cDNA抑制K562细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成

目的 探讨转染反义血管内皮细胞生长因子 (VEGF)cDNA对慢性髓系白血病 (CML)急变细胞株K5 6 2裸鼠体内生长的影响。方法 利用转染反义 (AS)、正义 (S)VEGF1 2 1 cDNA及空载体 (V ,pcDNA3质粒 )的K5 6 2细胞株 ,观察转染细胞在裸鼠体内成瘤及生长情况 ;免疫组化法比较其裸鼠移植瘤微血管密度 (MVD) ;MTT法观察其对骨髓内皮细胞体外增殖的影响。结果 转染反义VEGF1 2 1 cDNA的K5 6 2 AS细胞组的瘤块体积小、生长慢于K5 6 2 V组 [(2 0 7.5± 192 .9)mm3 vs (4 45 .0± 15 0 .9)mm3 ,P <0 0 5 ],而K5 6 2 S组瘤块体积大于K5 6 2 V组 [(1174.6± 5 0 8.7)mm3 vs (4 45 .0± 15 0 .9)mm3 ,P <0 .0 1]。K5 6 2 AS组裸鼠体内肿瘤MVD低于K5 6 2 V组 [(11.0± 7.6 ) 0 .72mm2 vs (18.9± 7.0 ) 0 .72mm2 ,P <0 0 5 ],而K5 6 2 S组则高于K5 6 2 V组 [(5 0 .8± 11.7) 0 .72mm2 vs (18.9± 7.0 ) 0 .72mm2 ,P <0 .0 1]。K5 6 2 AS细胞的培养上清刺激骨髓内皮细胞增殖能力弱于K5 6 2 V ,而K5 6 2 S细胞的结果相反。结论 转染反义VEGF1 2 1 cDNA抑制K5 6 2细胞裸鼠体内肿瘤生长 ,降低裸鼠瘤块内MVD 。

反义基因转染抑制骨肉瘤中血管内皮生长因子表达的研究

目的 观察以腺相关病毒 (rAAV)为载体的血管内皮生长因子 (VEGF)反义基因转染的骨肉瘤细胞中VEGF蛋白的表达。方法 用不同量 (0、2 0、5 0、10 0、2 0 0、2 40 μl)的以rAAV为载体包装的反义VEGF基因 (rAAV antiVEGF)转染人骨肉瘤细胞系MG 63细胞 ,收集转染前后的培养细胞及上清 ,用链霉素抗生素蛋白 过氧化酶连接法 (SP)和免疫印迹法 (Western blot)检测VEGF蛋白的表达 ;用逆转录聚合酶链式反应 (PCR)检测VEGFmRNA表达。结果 SP结果表明转染rAAV antiVEGF基因的量越多 ,显色越淡 ;Western Blot结果表明转染rAAV antiVEGF基因的量越多 ,其灰度越低。测得不同量 (0、2 0、5 0、10 0、2 0 0、2 40 μl)的转染基因其相应的吸光度值分别为 86614± 13 776、73 2 45± 15 414、610 78± 12 12 4、5 465 7± 10 95 3、3 980 2± 113 0 8、3 2 0 14±15 0 5 7,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;PCR检测其灰度值分别为 0 .986、0 .913、0 .784、0 .60 6、0 .43 1、0 .40 8,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论 rAAV antiVEGF可封闭VEGFmRNA ,使已转染rAAV antiVEGF的MG 63细胞表达的VEGF蛋白减少。

Bcl-XL反义寡核苷酸转染对食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的抑制作用

目的探讨Bcl-XL反义寡核苷酸转染后,对食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的影响。方法采用阳离子脂质体介导的反义寡核苷酸转染、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western蛋白印迹杂交、四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)、流式细胞术及凋亡的原位末端标记(TUNEL)检测等方法观察了Bcl-XL反义寡核苷酸转染对食管癌细胞增殖、凋亡的影响及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的影响。结果MTT法检测显示,Bcl-XL反义寡核苷酸可显著抑制食管癌细胞的增殖(P<0.05);对Bcl-XLmRNA表达抑制率为57.3%,可显著下调Bcl-XL的蛋白表达;应用流式细胞术和TUNEL检测技术,反义寡核苷酸组的凋亡率分别为(31.1±5.8)%和35.0%,与相关对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。反义寡核苷酸组裸鼠体内人食管癌移植瘤的生长受到显著抑制(P<0.05)。Bcl-XLmRNA及蛋白表达亦受到明显抑制,并且移植瘤组织中凋亡细胞明显增加。结论Bcl-XL反义寡核苷酸可有效抑制食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤的生长。通过反义寡核苷酸下调Bcl-XL的表达,达到治疗食管癌的目的,为食管癌的基因治疗提供实验依据。

肾癌相关新基因GYLZ-RCC18反义寡核苷酸转染对肾癌细胞系GRC-1的作用

目的 探讨肾癌相关新基因GYLZ RCC18在肾癌发生发展中的作用机制。 方法 采用逆转录PCR方法检测GYLZ RCC18在肾癌和正常肾细胞系中的表达 ,将第一编码区起始处的2 0个碱基的反义和正义寡核苷酸导入肾癌细胞系GRC 1,连续观察对肾癌细胞生长、增殖凋亡、死亡率、形态学的影响。 结果 GYLZ RCC18在肾癌细胞系中表达明显高于正常肾细胞系 ;导入GYLZ RCC18反义寡核苷酸后 ,GRC 1细胞的核分裂可明显减少 ,导致GRC 1细胞死亡 ,抑制癌细胞的生长和增殖活性 ,并可特异诱导GRC 1连续凋亡。 结论 GYLZ RCC18是肾癌发生发展密切相关的癌基因 ,其表达可促进肾癌细胞的生长和增殖 ,并通过抗癌细胞死亡和凋亡机制对癌细胞起保护作用。

Ezrin在肝癌中的表达及其与肿瘤黏附、侵袭和门静脉癌栓的关系

目的 探讨细胞骨架连接蛋白 (ezrin)在肝癌组织和细胞系中的表达及其与肿瘤黏附、侵袭和门静脉癌栓的关系。方法 4 1例肝细胞肝癌及其癌旁肝组织标本按肿瘤大小、有无播散灶及远处转移、包膜、门静脉癌栓等分为高侵袭和低侵袭 2组并与同期 9例良性肝病肝组织作比较 ,分别采用RT PCR和免疫组化技术检测ezrin表达。另选MHCC97L、MHCC97H和LM 33株肝癌细胞系并检测ezrin表达 ;同时运用脂质体转染反义寡核苷酸抑制MHCC97H细胞ezrin表达 ,比较转染前后细胞黏附、侵袭能力的改变。结果 高侵袭肝癌ezrin表达显著高于低侵袭肝癌 (P <0 .0 5 ) ,癌栓组织ezrin表达强度更高 (P <0 .0 5 )。MHCC97L、MHCC97H和LM33株细胞系均表达ezrin ,其强度随侵袭性增加依次增强。脂质体转染反义寡核苷酸能显著抑制MHCC97H的ezrin表达以及黏附、侵袭能力。结论 Ezrin在肝癌、门静脉癌栓和MHCC97L、MHCC97H、LM3细胞系中均表达 ,其表达强度随侵袭性增强而增加 ;Ezrin可能主要通过影响肿瘤黏附、侵袭能力 ,从而在肿瘤侵袭及门静脉癌栓形成中起重要作用。