hREV3基因表达被反义阻断的人胚肾细胞系的建立及其某些生物学特性观察

目的：建立 ｈＲＥＶ３基因表达反义阻断的细胞系并观察其生长特性与对烷化剂 Ｎ－甲基－Ｎ’－硝基－Ｎ－亚硝胍（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，ＭＮＮＧ）敏感性的改变。方法：利用改良磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法分别将本室构建的持续和诱导表达反义ｈＲＥＶ３ ＲＮＡ的真核细胞重组表达质粒ｐＢＫ－ＲＳＶ－ｈＲＥＶ３和ｐＭＡＭｎｅｏ－ａｍｐ－－ｈＲＥＶ３转染人胚胎肾细胞（ＨＥＫ－２９３细胞），经Ｇ４１８筛选，建立相应的细胞系２９３－Ｂ－ｈＲＥＶ３－和２９３－Ｍ－ｈＲＥＶ３。通过细胞计数方法观察这些细胞系的生长速率和不同浓度ＭＮＮＧ对细胞的细胞毒作用。结果：持续或诱导阻断ｈＲＥＶ３基因的表达对细胞生长速率均无影响；反义阻断细胞系对ＭＮＮＧ的细胞毒作用比母本２９３细胞较为敏感。结论：ｈＲＥＶ３基因的编码产物并非细胞生长所必需而可能在细胞的ＤＮＡ损伤修复中起作用。

反义阻断CROC-1基因表达导致细胞生长变慢

目的 :建立CROC - 1基因表达被阻断的FL -CROC - 1-细胞系 ,研究CROC - 1基因在细胞生长中的作用。方法 :运用反义技术将新近发现的人泛素缀合酶样蛋白基因CROC - 1的适当长度cDNA片断克隆到本室改建的真核细胞表达载体pMAMneo -amp-中 ,经限制性内切酶图谱分析筛选出反向插入的表达CROC - 1反义RNA的重组质粒。将此反义表达重组质粒 (pMAM -antiCROC - 1)用改良的磷酸钙法转染人羊膜FL细胞并用含G418的培养基筛选 ,测定G418抗性的FL -CROC - 1-细胞系的生长速度。结果 :建立的FL-CROC - 1-细胞系在地塞米松诱导下CROC - 1基因表达被反义抑制后 ,其生长速度较对照FL细胞及转染了载体pMAMneo -amp-的FL细胞 (FL -MAMneo)的明显要慢 (P <0 0 5 )。结论 :本研究成功地建立了CROC -1基因表达被阻断的FL -CROC - 1-细胞系 ,并提示CROC - 1基因编码的泛素缀合酶样蛋白在细胞生长中起正调控作用。

反义阻断REV3基因表达对细胞自发突变和MNNG诱导突变的影响

目的 :通过反义核酸技术研究REV3基因对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因HPRT的自发突变频率及烷化剂甲基硝基亚硝基胍 (methy1-nitro -nitrosoguanidine ,MNNG)的诱发突变频率的影响。方法 :用REV3基因反义核酸表达质粒pMAM -REV3-转染人羊膜上皮细胞 (FL) ,建立了由地塞米松诱导下的REV3基因表达可被反义阻断的细胞系 (FL-REV3-) ,并应用经典的筛选HPRT基因位点的突变子的实验进行REV3基因对HPRT基因位点的自发与诱发突变影响的检测研究。结果 :在自发突变率的检测中 ,FL细胞系的自发突变率比它的诱发突变率低 3 0 1倍 (P <0 0 5 ) ,而在FL -REV3-细胞系中始终未能筛选到自发突变子 ;用 0 .4 μmol/LMNNG分别处理FL -REV3-和FL细胞系 ,前者诱发突变率比后者低 6 0 2倍 (P <0 0 5 )。结论 :REV3基因不仅参与细胞自发突变 ,而且参与细胞的诱发突变 。

人类细胞周期蛋白D_3反义表达质粒的构建

目的 :构建人类细胞周期蛋白 D3(cyclin D3)反义表达质粒 ,为今后利用反义核酸阻断技术研究 cyclinD3基因的功能提供基础。方法 :运用 DNA重组技术将人 cyclin D3基因反向克隆到真核表达载体 pc DNA3.1中 ,构建成 cyclin D3反义表达质粒 pc DNA3- ascyclin D3。结果 :通过酶切鉴定及测序分析证实 ,实验成功构建了人 cyclin D3反义表达质粒。结论 :cyclin D3反义表达质粒 pc DNA3- ascyclin D3的成功构建 ,为进一步研究 cyclin D3的生物学功能及其在肿瘤发生、发展。