反义hTERT对人肺巨细胞癌细胞系端粒酶活性的抑制作用

背景与目的:近几年的研究表明,端粒酶在肿瘤的发生中扮演着重要角色。人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetrascriptase,hTERT)是端粒酶活化的惟一限制性组分。本研究探讨hTERT全长cDNA反义序列转染对人肺巨细胞癌细胞系PLA-801D恶性表型的逆转作用。方法:应用基因重组技术构建包含hTERTcDNA全长序列的反义hTERT真核表达载体pcDNA3.1(-)-hTERT,用脂质体转染人肺巨细胞癌细胞系PLA-801D,通过生长曲线比较转染反义hTERT后PLA-801D细胞的增殖能力,应用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERTmRNA的表达水平,并应用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附法检测端粒酶活性。结果:成功地构建了pcDNA3.1(-)-hTERT的反义真核表达载体,并转入到PLA-801D细胞中。转染反义hTERT的细胞较未转染及转染空质粒细胞的生长增殖能力显著降低(P<0.05);转染组细胞中野生型hTERTmRNA的表达被抑制,其相对表达量仅为对照组细胞的15.7%,转染组细胞中端粒酶活性较对照细胞下降了约82.4%。结论:hTERTcDNA的全长反义序列可以抑制PLA-801D细胞hTERTmRNA的表达水平和端粒酶活性,限制PLA-801D细胞的生长。

反义hTERT基因对K562细胞凋亡及周期的影响

目的:探讨反义hTERT基因抑制K562细胞端粒酶活性对其细胞周期及增殖的影响。方法:用脂质体介导反义hTERT基因和空载体质粒转染K562细胞株,绘制生长曲线,MTT法检测细胞活性,血清饥饿法同步化细胞周期,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率变化。结果:反义hTERT基因转染后,细胞生长明显受到抑制。细胞同步化后,流式细胞仪检测显示:KA组细胞出现早期凋亡峰,细胞阻滞于S期。但正常培养48h,各组细胞无明显凋亡,周期无显著差异。结论:反义hTERT基因可明显抑制K562的增殖,细胞同步化后具有促凋亡作用。

反义hTERT体外抑制白血病细胞增殖的研究

目的研究反义hTERT基因对白血病细胞体外增殖的抑制作用。方法体外通过SuperFect将已构建好的正、反义hTERT真核表达载体转染HL60白血病细胞,再经过G418及PCR筛选鉴定分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞HL60-s和HL60-as。随后运用实时荧光定量RT-PCR技术及TRAP-银染法对各组细胞内源性hTERT mRNA的表达情况及端粒酶的活性进行检测。同时还采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析反义hTERT对白血病细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡。结果与空白对照、正义hTERT组相比,反义hTERT能显著地降低HL60细胞内源性hTERT mRNA的表达(P<0.01)和下调端粒酶活性。当各组细胞传至第25代后,与HL60、HL60-s比较,HL60-as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低,同时伴有凋亡率的显著增加。结论反义hTERT在体外能抑制白血病细胞的生长增殖能力,其潜在、广谱的抗肿瘤作用的分子生物学机制可能是首先通过抑制和下调hTERT表达(端粒酶活性)而最终引发瘤细胞衰亡的途径来实现的。

反义hTERT对人肺巨细胞癌细胞系p53表达的影响

目的:本研究以端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetrascriptase,hTERT)基因的全长序列构建反义hTERT的真核表达载体,以此来转染肿瘤细胞PLA 801D,观察反义hTERT对其细胞周期分布及对p53表达的影响。方法:构建了包含hTERT全长基因序列的反义hTERT基因真核表达载体pcDNA3. 1(-) -hTERT,并稳定转染人肺巨细胞癌细胞系PLA 801D,观察基因转染前后,流式细胞术检测PLA 801D细胞的周期分布,用半定量RT- PCR检测p53mRNA的表达水平,免疫组化检测突变型p53蛋白阳性表达率的差异。结果:全长的反义hTERT基因可显著地抑制p53mRNA的表达,使细胞周期的分布出现G0 /G1期阻滞,突变型p53蛋白阳性率显著下降。结论:反义的hTERT基因可有效的抑制p53mRNA及突变型蛋白的表达水平,引起细胞周期阻滞,使细胞的恶性增殖减缓。

反义hTERT在体外对HL-60细胞的抑制作用

[目的 ]探讨反义hTERT表达质粒是否能够抑制HL - 6 0细胞增殖能力及端粒酶活性。 [方法 ]通过脂质体法将反义hTERT表达质粒导入HL - 6 0细胞中 ;以G4 18进行筛选得到阳性克隆 ;以MTT法和体外集落形成实验检测反义hTERT表达质粒对HL - 6 0细胞增殖的抑制作用 ;以TRAP -PCRELISA法来研究反义hTERT对HL - 6 0细胞的端粒酶活性的抑制作用。 [结果 ]转染反义hTERT表达质粒组与空白对照及空质粒组相比 ,细胞增生速度明显较慢 ,克隆形成能力明显下降 (P <0 .0 1) ;反义hTERT对HL - 6 0细胞的端粒酶活性具有明显的抑制作用。 [结论 ]本研究构建的端粒酶反义hTERT表达质粒能够抑制HL - 6 0细胞的体外增殖能力及其端粒酶活性。

反义hTERT基因对白血病细胞端粒酶表达及活性的抑制作用

目的 探讨反义hTERT基因体外对白血病细胞端粒酶基因表达及其活性的抑制作用。方法 采用基因重组技术设计并构建了针对端粒酶活性蛋白催化亚单位mRNA的 5′端序列的反义pcDNA hTERT真核表达载体 ,通过SuperFect(QIAGEN)将其瞬时转染人早幼粒白血病细胞株HL60 及人红白血病细胞株K562 ,并运用流式细胞术测定其细胞凋亡与细胞周期的变化 ,同时运用实时荧光定量逆转录 聚合酶链反应方法对其端粒酶蛋白催化亚单位基因的表达水平进行了检测 ,端粒酶活性的检测则采用了非放射性TRAP 银染法。结果 成功地构建了反义pcDNA hTERT真核表达载体 ,并将其转染至K562 和HL60 白血病细胞株。结果与空载体组、空白组相比 ,反义 pcDNA hTERT组体外显示出明显有效地抑制端粒酶的基因表达及其活性的作用 ;在细胞凋亡与细胞周期方面 ,反义组能引起细胞周期左移 ,增殖分裂能力降低 ,同时伴有细胞凋亡数的增加。结论 研究构建的反义hTERT基因体外确实能明显有效地下调白血病细胞端粒酶的基因表达及其活性 。

反义hTERT/PTEN联合基因治疗恶性胶质瘤的体内外研究

目的探讨腺病毒介导的反义hTERT和野生型PTEN联合基因转染对恶性胶质瘤细胞生长的影响。方法用细菌内高效同源重组系统构建的含有hTERT反义序列及野生型PTEN的腺病毒在体内外单独或联合转染恶性胶质瘤细胞系U251,检测肿瘤细胞生长情况、端粒酶活性、蛋白表达、细胞周期变化等。结果在体外试验中单独或联合转染都能明显抑制肿瘤细胞的生长,以联合转染效果最明显,转染后第6天联合转染组的细胞生存率为37.6%,端粒酶活性水平和hTERT蛋白表达水平明显下降,分别为28·8TPG、0.2106,PTEN蛋白表达水平上升为0.9630;在体内试验中肿瘤生长也明显减慢。结论腺病毒介导的反义hTERT和野生型PTEN联合转染能明显抑制恶性胶质瘤细胞的生长。

反义hTERT对K562细胞端粒酶活性及细胞增生的影响

目的 :观察反义 h TERT表达质粒转染 K5 6 2细胞后是否能够抑制端粒酶活性及K5 6 2细胞的增生。方法 :质粒的构建与转染 :将 2 90 bp h TERT c DNA片段 ,反向连接于 p L NCX- neo质粒上得到反义 h TERT基因表达质粒。在体外转染中通过脂质体法将质粒导入 K5 6 2细胞中 ,以G4 18进行筛选得到阳性克隆 ;以 MTT法和形态学法检测反义 h TERT表达质粒对 K5 6 2细胞增生的抑制作用 ;以 TRAP- PCR EL ISA法来研究反义 h TERT基因对 K5 6 2细胞的端粒酶活性的抑制作用。结果 :转染反义 h TERT表达质粒组与对照组 (空白对照及空质粒组 )相比较 ,生长速率明显变慢 ,部分细胞出现凋亡等形态学改变。反义 h TERT对 K5 6 2细胞的端粒酶活性具有明显的抑制作用。结论 :研究构建的端粒酶反义 h TERT基因表达质粒转染到 K5 6 2细胞中后 ,能够封闭 K5 6 2细胞h TERT- m RNA的表达 ,在抑制端粒酶活性的同时 ,减慢了 K5 6 2细胞的生长速度。

反义hTERT体外诱导肺癌细胞凋亡的研究

目的研究反义hTERT基因体外诱导肺癌细胞凋亡。方法体外通过SuperFect(QIAGEN)转染正、反义hTERT真核表达载体至人肺腺癌细胞株GLC82,再经过G418及PCR筛选鉴定获得分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞GLC82s和GLC82as。然后采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析了反义hTERT对肺癌细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡;同时还运用实时荧光定量RTPCR技术及TRAP银染法对各组细胞内源性hTERTmRNA的表达情况及端粒酶的活性进行了检测。结果当各组细胞传至第25代后,与GLC82、GLC82s比较,GLC82as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低,同时伴有凋亡率的显著增加;与空白对照、正义hTERT组相比,反义hTERT能显著地降低GLC82细胞内源性hTERTmRNA的表达(P<0.01)和下调端粒酶活性。结论反义hTERT体外确实能明显地诱导肺癌细胞的凋亡及抑制瘤细胞的生长增殖能力。

反义hTERT抑制恶性胶质瘤生长的体内外研究

目的探讨腺病毒介导的反义hTERT在体内外对恶性胶质瘤细胞生长的影响。方法构建含有hTERT反义序列的腺病毒载体在体内外转染恶性胶质瘤细胞系U251，检测肿瘤细胞生长情况、细胞周期变化、端粒酶活性、hTERT蛋白表达等。结果腺病毒介导的hTERT反义治疗在体外明显抑制肿瘤细胞生长，增殖减慢，凋亡增多，细胞较多聚集在G0／G0期，转染后第6天细胞生存率为46．9％，端粒酶活性和hTERT蛋白表达都明显下降，在体内实验中肿瘤生长明显减慢。结论腺病毒介导的反义hTERT在体内外能明显抑制恶性胶质瘤细胞的生长。

反义hTERT可促进肺癌细胞A549凋亡

河 北医科大学第三医院呼吸内科主任田凤军和加强医疗科王智勇采用反义人端粒酶逆转录酶(bTERT),探讨了对肺癌细胞A549端粒酶活性和细胞增生的抑制作用,以寻找以端粒酶为靶点的基因治疗方法。通过将端粒酶hTERT的cDNA反向插入逆转录病毒载体中。

PLGA纳米载体介导的端粒酶hTERT反义核酸对裸鼠肝癌移植瘤的影响

目的通过以PLGA纳米粒作为端粒酶hTERT反义核酸的载体,促进反义核酸对肝癌瘤组织的抑制。方法以HepG-2肝癌细胞和裸鼠建立肝癌移植瘤实验模型;观测瘤重和成瘤率;流式细胞仪检侧肿瘤细胞凋亡及细胞周期的特点。结果与对照组相比,治疗组肿瘤细胞凋亡数明显增加,细胞增殖受到抑制,肿瘤生长缓慢,出瘤时间推迟。结论以PLGA纳米粒作为端粒酶反义核酸的载体,能显著延缓裸鼠肝癌移植瘤的发展,产生明显的疗效。

hTERT反义基因对舌鳞癌Tca8113细胞端粒酶活性的影响

目的研究hTERT反义基因对舌鳞癌Tca8113细胞株的影响。方法应用RT-PCR法获得反义hTERT基因并转染舌鳞癌细胞,采用TRAP-DNA测序法检测转染前后细胞的端粒酶活性,并对细胞生长速度和倍增时间进行比较。结果转染后细胞的端粒酶活性及生长速度较转染前明显下降。结论hTERT反义基因的表达可显著抑制舌鳞癌细胞的端粒酶活性和生长速度。

反义人端粒酶逆转录酶基因转染对人胃癌细胞系的影响

目的探讨反义人端粒酶(hTERT)基因治疗的可行性。方法构建hTERT基因的反义表达载体,经脂质体介导转染人未分化胃癌细胞系HGC-27,通过Southernblot检测外源反义基因的整合;RT-PCR及DNA测序法检测反义基因的转录;RT-PCR半定量方法检测被封闭目的基因mRNA的转录水平;TRAP及PCRELISA方法检测细胞的端粒酶活性;流式细胞仪检测细胞周期变化。结果外源反义hTERT基因已整合入细胞并获稳定转录,且能显著封闭目的基因转录的mRNA,并显著抑制HGC-27细胞的端粒酶活性,抑制HGC-27细胞的增殖并促进其凋亡。结论端粒酶反义hTERT基因可有效地应用于胃癌的基因治疗。