农杆菌介导的反义LeERF2基因转化番茄

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法将LeERF2反义基因导入中蔬四号番茄(Lycopersicon esculentumcv.No.4 Zhongshu)进行遗传转化研究。在卡那霉素选择压力下获得的再生植株,经过PCR、点杂交和Southern杂交鉴定,证实了该反义基因已导入番茄基因组中,共获得了25棵转基因植株,并建立了一个高效的番茄转化体系。Northern杂交结果表明,转反义LeERF2基因番茄果实外果皮LeERF2基因表达水平比野生型番茄低。

甘蓝型油菜fad2基因片段的克隆和反义表达载体的构建

从甘蓝型油菜湘油 15号基因组中分离总DNA ,以此为模板进行多聚酶链式反应 (PCR)。PCR产物与克隆载体 pGEM -TEasy连接 ,经NotI酶切后插入 pBluescriptIISK +。序列测定表明 ,PCR产物为 6 5 4bp的DNA片段 ,fad2基因片段只朝 pBluescriptIISK +的T3-T7方向插入 ,经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI12 1相同的酶切位点 ,构建反义 fad2表达载体。

转TERF1和LeERF2双价基因旱稻及其逆境光合特性研究

为了提高旱稻对干旱、盐及低温综合胁迫的抗性,构建了含有抗旱抗盐功能的TERF1和抗盐抗冷功能的LeERF2转录因子的双价植株表达载体;以秦爱、旱65和旱297三种旱稻品种为材料,通过农杆菌介导法将以上两转录因子转入受体材料中,获得了经PCR及Southern检测证实同时整合双价基因的T0及T1转基因植株。T1代转基因植株经不同程度NaCl、PEG、冷单一逆境处理和冷盐综合逆境处理后,仍保持着较高的净光合速率(Pn)和PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm),能量转换机构不易受损,有较强的光保护机制。3个品种的转基因株系对这三种胁迫的抗性均比对照有明显提高。

新型bcl-2基因反义寡核苷酸F951诱导人白血病HL60细胞凋亡

目的观察新型bcl-2反义寡核苷酸F951诱导人白血病细胞凋亡的作用。方法不同浓度的F951与HL60细胞共培养后,采用流式细胞术,DNA Ladder分析,电镜观察,TdT酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞。结果5,10,20μmol.L-1F951分别与HL60细胞共孵育48h后,线粒体凋亡细胞:未处理组、FNS对照组分别为3.00%、13.57%,F9513个剂量分别为30.95%、38.08%、52.55%;Caspase活性细胞:未处理组、FNS对照组分别为0.08%、0.14%,F9513个剂量组分别为43.68%、60.54%、80.37%。凝胶电泳分析:F951处理组可见典型的DNALadder,且随着药物浓度的提高诱导DNA Ladder的作用更加明显;TUNEL和电镜检查:未处理组与FNS对照组中仅偶见凋亡细胞,F951各剂量组凋亡细胞常见,且随着药物浓度的提高凋亡细胞增多。结论F951具有诱导HL60细胞凋亡的作用;F951诱导肿瘤细胞凋亡的作用是通过抑制bcl-2基因,启动细胞凋亡调控通道而实现的。

根癌农杆菌介导反义fad2-1基因转化大豆的研究

通过根癌农杆菌介导法将反义fad2-1基因导入大豆子叶节,研究了农杆菌菌液浓度、预培养时间、共培养时间、恢复培养时间、乙酰丁香酮浓度和pH值对大豆子叶节形成丛生芽的影响,建立了有效的转化体系,获得了转基因大豆再生植株。PCR、PCR-Southern blotting检测结果表明,反义fad2-1基因成功转入并整合于大豆基因组。GC检测结果表明,转反义fad2-1基因大豆种子油酸含量比非转基因大豆种子的油酸含量提高了14.44%,而亚油酸含量降低了20.27%。

玉米淀粉分支酶sbe2a基因反义载体的构建及其转基因初步研究

应用PCR技术克隆了玉米淀粉分支酶sbe2a基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并进行序列比对。结果表明:克隆片段长度为562 bp。将该基因反向插入到pWGLL载体Actin-pro启动子下游,构建高效反义表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系"铁7922",经PCR检测初步证明外源基因已整合到玉米基因组中。

C-erbB-2与c-raf-1基因反义寡核苷酸联合对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用

背景与目的:针对c-erbB-2与c-raf-1单基因的反义寡脱氧核苷酸(antisenseoligodexynucleotide,ASODN)治疗肿瘤的研究报道很多,这些研究往往局限于单个基因或细胞水平,从肿瘤发生的多基因学说上讲是不恰当的。本研究旨在探讨c-erbB-2与c-raf-1基因联合ASODN对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用。方法:在BALB/c裸鼠上建立卵巢上皮癌模型,然后随机分成阴性对照组和6个实验组(分别为脂质体c-erbB-2SODN组、脂质体c-raf-1SODN组、脂质体c-erbB-2ASODN组、脂质体c-raf-1ASODN组、全剂量联合反义给药组、半剂量联合反义给药组)。检测裸鼠体重及肿瘤体积变化,计算抑瘤率及肿瘤缩小率。结果:给药后,全剂量联合反义给药组与半剂量联合反义给药组的肿瘤体积抑瘤率分别为72.5%和78.4%,肿瘤重量抑瘤率分别为70.7%和75.3%,肿瘤缩小率分别为29.7%和41.6%。在给药后,各组裸鼠体重变化无明显统计学差别。结论:C-erbB-2与c-raf-1基因联合ASODN在体内能明显地抑制肿瘤生长。

黄瓜花叶病毒反义2b基因构建及其转基因初步研究

研究构建了CMV反义2b基因的植物表达载体pZM6.2,通过农杆菌侵染的叶盘转化法导入烟草,分子检测证实获得了转反义2b基因的SR1烟草转基因植株,初步的CMV攻毒试验表明反义2b基因可介导对CMV的抗性。在此基础上,将pZM6.2转化番茄品种‘红玛瑙213’,获得了卡那霉素抗性苗,PCR检测表明得到了PCR阳性转化株。

bcl-2基因的反义寡核苷酸与三氧化二砷联合对恶性淋巴瘤细胞系凋亡的影响

目的 :研究bcl 2基因的反义寡核苷酸与三氧化二砷 (As2 O3 )联合对恶性淋巴瘤细胞系凋亡的影响。方法 :采用细胞染色方法观察细胞凋亡的形态 ,原位末端标记法 (TUNEL)检测凋亡细胞 ,流式细胞仪检测细胞的DNA含量和bcl 2蛋白的表达。结果 :10～ 4 0 μmol/Lbcl 2基因的反义寡核苷酸和 0 .5～ 2 .0 μmol/L三氧化二砷均能抑制恶性B淋巴瘤细胞系Raji细胞生长 ,诱导细胞凋亡 ,流式细胞仪检测Raji细胞 ,发现亚G1期细胞明显增多 ,bcl 2蛋白的表达明显降低 ,呈现时间剂量依赖效应 ,两者联合应用比单独应用抑制作用显著。结论 :bcl 2基因的反义寡核苷酸与三氧化二砷联合应用 ,明显抑制恶性B淋巴瘤细胞系生长 。

人TLR4及MD2基因反义真核表达载体的构建

目的 构建人TLR4及MD2基因反义真核表达载体 ,为研究其在肺炎症反应中的作用奠定基础。方法 通过PCR技术扩增出TLR4及MD2基因片段 ,然后分别反向插入真核表达载体pEFBOS的多克隆位点 ,最后对产生的重组子进行酶切和测序鉴定。结果 扩增出的TLR4目的片段为 2 6kb ,MD2为 0 5kb ,并成功地连接到pEFBOS载体上 ,DNA测序结果也显示插入片段为目的片段。

反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL－60细胞中bcl－2基因表达的研究

目的：研究ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２基因的表达并探索ｂｃｌ－２基因ｍＲＮＡ特异的反义寡聚脱氧核苷酸（反义ＯＤＮ）对ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２基因表达的影响．方法：采用细胞原位杂交和免疫细胞化学染色技术检测ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２基因的表达，人工合成ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ特异性反义ＯＤＮ片段与ＨＬ－６０细胞共培养，在作用一定时间后分别测定细胞中ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ和Ｂｃｌ－２蛋白表达的变化．结果：ｂｃｌ－２基因在ＨＬ－６０细胞中既有转录水平的高表达，又有翻译水平的高表达，人工合成的反义ＯＤＮ片段在一定浓度范围内，作用一段时间后细胞内ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表达无显著改变，而蛋白表达却呈现了显著下降，与浓度和作用时间呈正相关．结论：人工合成的反义ＯＤＮ片段可以抑制ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２的转录作用．在进行白血病基因治疗的实验研究中，ｂｃｌ－２基因可以作为基因治疗的一个有用的靶基因．

中间锦鸡儿fad2基因片段克隆、反义表达载体构建及遗传转化初步研究

以我国重要的生物能源灌木——中间锦鸡儿枝叶和种子为材料,根据GenBank中已经发表fad2基因的同源序列,利用PCR技术克隆得到基因片段。在GenBank中Blast(GenBank登录号AY957393)所得基因片段和同属豆科的Glycine max Gmfad2-2a同源性高达88%,位于fad2基因编码区中部。将所得片段经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI121,构建了反义表达载体pBI121fad2,并利用农杆菌介导法转入烟草叶片,获得了抗卡那霉素和氨苄青霉素的再生烟草植株。初步分析结果表明:与对照烟草相比,转基因烟草种子脂肪酸含量没有明显差异,而亚油酸则减少10.3%。

凋亡抑制基因survivin反义寡核苷酸联合bcl-2反义寡核苷酸诱导肺癌细胞株凋亡的实验观察

目的探讨凋亡抑制基因survivin反义寡核苷酸单用或联用bcl-2反义寡核苷酸对肺癌细胞株的作用,探讨其在抗癌方面的作用。方法①实验于2002-08/2003-04在蚌埠医学院免疫学实验室完成。将对数生长期NCI-H446细胞分为6组空白对照组,脂质体10m g/L组(仅加空脂质体),NSODN500nm ol/L组(该3组均为对照组),survivin反义寡核苷酸500nm ol/L组,bcl-2反义寡核苷酸5μm ol/L,survivin反义寡核苷酸500nm ol/L+bcl-2反义寡核苷酸5μm ol/L组(分别在脂质体介导下转染不同寡核苷酸,48h后收取细胞进行以下检测)。②在脂质体介导下,以survivin的反义寡核苷酸作用于肺癌细胞株NCI-H446和SPC-A1,于72h用反转录聚合酶链反应检测survivin mRNA表达。凋亡指数=(静止期/DNA合成前期)占整个细胞周期的百分比;增殖指数=(DNA复制期+合成后期/有丝分裂期)占整个细胞周期的百分比。②survivin反义寡核苷酸单独或联合bcl-2反义寡核苷酸作用NCI-H446后,用四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长抑制率并计算两药相互作用指数,锥虫蓝拒染实验检测细胞死亡率。③计量资料差异性比较采用方差分析和q检验。结果①两种肺癌细胞株皆表达survivin基因。survivin反义寡核苷酸作用细胞株后,出现生长抑制和细胞凋亡,细胞survivin m RNA明显下调,反义寡核苷酸500nm ol/L作用72h后NCI-H446和SPC-A1细胞survivin m RNA抑制率分别达62.72%和67.43%。②四甲基偶氮唑盐法检测结果显示,survivin反义寡核苷酸和bcl-2反义寡核苷酸单独应用对NCI-H446细胞均有生长抑制作用;联合应用survivin反义寡核苷酸和bcl-2反义寡核苷酸的细胞生长抑制率为64.9%,优于单独应用(单用bcl-2反义寡核苷酸为34.2%)(P<0.01),两药相互作用指数为0.708。锥虫蓝拒染实验显示,survivin反义寡核苷酸500nm ol/L+bcl-2反义寡核苷酸5μm ol/L组细胞死亡率为62.1%,高于两药单用时的31.4%和41.4%。流式细胞仪检测凋亡显示,与各对照组相比,survivin反义寡核苷酸和bcl-2反义寡核苷酸均可诱导细胞凋亡,凋亡率分别为43.6%和30.7%,两者联用凋亡率提高到58.6%(P<0.01)。结论①survivin反义寡核苷酸能抑制肺癌细胞株survivin基因表达,并诱导细胞凋亡和抑制生长。②survivin反义寡核苷酸联合bcl-2反义寡核苷酸具有显著协同抗癌作用。

bcl-2基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响

目的：探讨ｂｃｌ－２基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响。方法：应用细胞培养，免疫标记及流式细胞仪技术，检测了ｂｃ１－２基因反义寡脱氧核糖核苷酸（ＡＳＯＤＮ）和阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）对白血病Ｋ５６２和ＨＬ－６０细胞作用和ｂｃｌ－２基因表达。结果：Ａｒａ－Ｃ（１０μｍｏｌ／Ｌ）与ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ同时作用比单独用Ａｒａ－Ｃ或Ａｒａ－Ｃ与正义寡脱氧核糖核苷酸（ＳＯＤＮ）细胞存活率显著减少（Ｐ＜０００１），并且流式细胞仪检测显示ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ使ｂｃｌ－２蛋白阳性率降低。结论：ｂｃｌ－２基因反义寡核苷酸能抑制该基因表达。

新型反义寡核苷酸F951对HL60细胞Bcl-2基因表达及细胞增殖的抑制作用

目的 研究新型反义寡核苷酸F951对白血病细胞Bcl- 2基因表达及细胞增殖的影响。方法 不同浓度的F951与HL60细胞共培养后,采用台盼蓝拒染法、MTT比色法检测HL60细胞增殖,用流式细胞术和RT -PCR法检测Bcl- 2蛋白及其mRNA表达,DNA片段化分析法检测凋亡细胞。结果 5, 10, 20μmol·L-1F951分别与HL60细胞共孵育1~5d,细胞生长明显受抑,这一抑制作用随F951浓度的升高和作用时间的延长而增强。MTTA值与未处理组相比F951 5, 10, 20μmol·L-1组细胞抑制率分别为: 20 .56%、37 .66%、54 .11%与对照组相比差异均有显著性;F951处理后HL60细胞Bcl 2mRNA水平下降,Bcl- 2蛋白减少;凝胶电泳可见典型的梯形带,且随着浓度提高诱导DNALadder的作用更加明显。结论 F951可下调Bcl -2基因表达,促进细胞凋亡而抑制白血病细胞增殖。

bcl-2基因反义寡核苷酸增强放射线诱导Raji细胞凋亡的研究

目的研究bcl-2基因反义寡核苷酸作用淋巴瘤细胞株Raji后,放射线对细胞凋亡的影响。方法bcl-2基因反义寡核苷酸作用Raji细胞后,台盼蓝拒染法计数活细胞;免疫荧光标记观测细胞Bcl-2蛋白水平;用姬姆萨染色和碘化丙啶染色法、流式细胞仪检测细胞凋亡。结果bcl-2基因反义寡核苷酸与放射线联合作用Raji细胞,显著抑制细胞的生长,并呈时间依赖性,活细胞数分别与单用放射线组及无义寡核苷酸联合放射线组相比,统计学上有显著性差异(P<0.05)。bcl-2基因反义寡核苷酸与放射线联合作用于Raji细胞后显著抑制bcl-2蛋白表达,蛋白水平分别与单用放射线组或无义寡核苷酸联用放射线组比较,差异有显著性(P<0.05)。bcl-2基因反义寡核苷酸与放射线同时作用于Raji细胞后,姬姆萨染色可见凋亡细胞,通过流式细胞仪检测的细胞凋亡率显著增加,分别与单用放射线组或无义寡核苷酸联用放射线组相比,具有显著性差异,P<0.05。结论bcl-2反义寡核苷酸能增强放射线诱导Raji细胞凋亡。

端粒酶逆转录酶基因hTERT在肝细胞癌中的表达及端粒酶反义基因对人肝癌细胞HepG2细胞凋亡的影响

目的:研究肝细胞癌(HCC)中端粒酶逆转录酶基因hTERT表达,探讨其在HCC发生、发展及预后复发中的意义.探讨抗端粒酶在肝细胞癌治疗中的意义.方法:采用免疫组化法检测42例HCC组织中hTERT的表达,并对hTERT与临床病理特征的关系进行分析.将反义hTR真核表达载体经脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化及致瘤性.结果:HCC中hTERT基因阳性率分别为71.4%(30/42);hTERT与在正常肝脏组织中阳性表达率0%相比,有显著性差异(P<0.01).hTERT在Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ级HCC中的表达率分别为40.0%(4/10),70.0%(14/20),100%(12/12).Ⅰ与Ⅲ级、Ⅱ与Ⅲ级比较差异显著(P<0.05).hTERT阳性表达率与患者复发有显著相关性(P<0.05).形态学观察,转染后HepG2细胞出现典型的凋亡现象.FCM检测发现G1期前出现凋亡峰.在裸鼠皮下的致瘤性明显降低.荷瘤鼠存活时间延长.结论:hTERT表达异常可能与肝脏肿瘤的发生、发展有关.检测hTERT表达可作为预测肝脏肿瘤预后复发的潜在指标.提示HCC是由多基因参与的疾病.转染端粒酶反义RNA能抑制肝癌HepG2细胞的恶性表型,促进其凋亡.

Bcr3/abl2和VEGF基因反义寡核苷酸联用增强对K562细胞的生长抑制作用

目的:研究BCR ABL和VEGF反义寡核苷酸联用对K5 62细胞株的作用及其相互作用的影响。方法:设计针对bcr3/abl2和VEGF的反义寡核苷酸(AS ODNs) ,应用脂质体Oligofectamine作为转染载体。在转染后72h进行台盼蓝染色细胞计数;建立裸鼠K5 62移植瘤动物模型,瘤内注射AS ODNs,观察肿瘤体积生长变化,组织学检测肿瘤血管密度和肿瘤细胞凋亡情况。结果:转染后72h ,各实验组与空白组相比,细胞增殖抑制率分别为1 3 .47% (ASO B3/A2组) ,1 2 . 79%(ASO VEGF组)和41 . 5 5 % (半量联合治疗组)。经过4次治疗后,与对照组相比,肿瘤生长抑制率分别为2 3 .1 8% (ASO B3/A2组) ,1 7. 2 8% (ASO VEGF组)和5 7 .83% (半量联合治疗组)。联合治疗组肿瘤生长速率显著低于单一治疗组,伴随明显的肿瘤细胞凋亡增加和肿瘤血管密度减少。结论:双基因反义寡核苷酸联合应用协同抑制K5 62细胞增殖,抗肿瘤作用明显优于单一治疗组,可为CML基因治疗提供一项新策略。

反义bcl-2基因逆转录病毒表达载体的构建

目的 克隆 bcl- 2基因 ,构建其不同反义核酸的逆转录病毒表达载体。 方法 设计一对两端带有Eco R 酶切位点的引物 ,RT- PCR克隆含 bcl- 2全部编码区的 848bp片段 ,并连接到 T载体 ,测序正确后正反向亚克隆到 p L XSN中 Eco R 位点 ;从 p Bluescript SK(- ) bcl- 2中用 Bam H 切下含有 bcl- 2阅读框起始部位的部分编码区亚克隆到 p L XSN Bam H 位点。 结果 构建带有正反向含 bcl- 2阅读框的全部编码区和部分编码区的逆转录病毒表达载体。 结论 在已知基因序列克隆中 ,联合 RT- PCR和 T载体是一个简单、快速、有效的方法 。

β_1受体反义基因治疗对两肾一夹高血压大鼠心肌Bcl-2的影响

目的比较两肾一夹(2K1C)肾性高血压大鼠心肌Bcl-2的表达,探讨阳离子脂质体混合物介导的β1受体反义基因治疗对肾性高血压大鼠血压及心肌Bcl-2表达的影响。方法将18只雄性SD大鼠随机分成3组,每组6只。其中2组12只用来制作两肾一夹高血压模型,作为两肾一夹组;6只作为假手术组,仅分离左肾动脉而不套银夹。两肾一夹模型又分为反义寡核苷酸(β1-AS-ODN)组(反义组)和反向寡核苷酸(Inverted ODN,β1-IN-ODN)组(反向组)。阳离子脂质体1,2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammo-nio)propane/cholesterol(DOTAP)和辅助脂质体l-a-dioleoyl hosphatidylethanolamine(DOPE)以1∶1的摩尔比混合。阳离子脂质体混合物(DOTAP/DOPE)与β1-AS-ODN、β1-IN-ODN混合的摩尔比率均为2.0,经鼠尾静脉注射。监测血压,8周后测定血流动力学指标,免疫组织化学方法检测3组大鼠心肌Bcl-2的表达。结果反义寡核苷酸治疗可使血压显著下降,单剂治疗可维持血压降低27 d,血压最大下降39mm Hg。反义组的心脏湿重/体重(HW/BW)也显著低于对照组(P<0.01)。两肾一夹组心肌Bcl-2表达明显高于假手术组,β1-IN-ODN组心肌Bcl-2表达明显高于β1-AS-ODN组。结论以β1受体为靶基因的反义基因对肾性高血压有效,单剂治疗降压持续时间长,而且在抑制血压和左室肥厚的同时也明显抑制心肌Bcl-2的表达,提示β1-AS-ODN对心肌Bcl-2的抑制在抗高血压靶器官损伤过程中起一定的作用。