腺病毒介导的反义VEGF与可溶性VEGF受体联合对实验性MM45T.Li小鼠肿瘤生长及转移的影响

目的:构建并观察含反义VEGF、sflt1、sflt1联合反义VEGF及lacZ的重组腺病毒对MM45T.Li小鼠肿瘤生长及转移的影响。方法:通过RTPCR从胚胎小鼠中克隆可溶性VEGF受体基因sflt1,并比较sflt1与3′末端缺失可溶性VEGF受体基因3′Δflt1在COS7细胞中的表达效率;将含反义VEGF的重组腺病毒和含lacZ报告基因的重组腺病毒分别感染MM45T.Li细胞株,观察反义VEGF体外抑制VEGF分泌的作用;采用CAM实验模型,观察含目的基因的重组腺病毒对鸡胚血管形成的影响;分别将含不同目的基因的重组腺病毒进行瘤内直接注射,每周体外测量肿块大小,7周后处死小鼠,观察有无转移,并对肿瘤组织冰冻切片后进行VEGF、可溶性VEGF受体(sflt1)表达及新生血管形成的免疫组织化学分析;余下的小鼠共观察13周,记录小鼠死亡时间,计算生存函数。结果:含反义VEGF的重组腺病毒感染MM45T.Li细胞后,能明显减少VEGF的分泌P<0.01;鸡胚注射Adsflt1、AdantisenseVEGF及Adsflt1/antisenseVEGF后,其血管的分布较注射AdlacZ组明显减少,甚至造成死胚;经sflt1、反义VEGF治疗的荷瘤小鼠肿瘤生长速度较对照组明显减慢(P<0.01),肿瘤体积明显变小(P<0.01),肿瘤转移率减少(P<0.05),13周生存率明显延长(P<0.01);而且反义VEGF与sflt1联合具有正叠加效应。

反义VEGF寡核苷酸与碘油混合肝动脉注入转染鼠肝癌的可行性

目的:探讨反义VEGF寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, ASODN)转染Walker-256瘤细胞及其与碘油混合后肝动脉注入转染鼠肝癌及在鼠肝、肺、肾组织的分布情况. 方法:将异硫氰酸荧光素(5’-FITC)标记的VEGF ASODN 加入培养的Walker-256瘤细胞培养液中,不同时间用荧光显微镜观察细胞内ASODN的分布.12只Walker-256移植性大鼠肝癌模型,一组肝动脉内注入荧光标记的VEGF ASODN(TAI组,n=6),另一组肝动脉内注入荧光标记的VEGF ASODN与超液态碘油的混合液(混合组,n=6),两组分别于术后1 d、3 d、6d取动物的肝、肺、肾组织行冰冻切片,荧光显微镜观察各组织内ASODN的分布情况. 结果:荧光标记的ASODN与Walker-256瘤细胞共同培养后2 h时可见瘤细胞胞质内有点状荧光染色,6 h胞核内有荧光染色,12 h荧光染色最强,胞核及胞质中均可见荧光染色,24h荧光物质减少,48h完全消失.1 d和3 d时混合组肝癌组织及肝组织内荧光染色强于TAI组,而肺、肾组织荧光染色弱于TAI组;6 d时TAI组肝、肺、肾组织内荧光染色基本消失,而混合组肝、肺、肾组织仍有少许荧光染色.ASODN可以进入肝癌细胞及瘤周肝细胞. 结论:VEGF ASODN可以转染Walker-256细胞,其与碘油混合后可以延长ASODN在肝内的停留时间,增加对肝癌组织的转染率,减少其在肝外组织的分布.与碘油混合后肝动脉注入是VEGF ASODN反义基因治疗肝癌的理想给药方法.

反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响

目的观察反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响。方法克隆人VEGF基因,将VEGF-cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义VEGF表达载体pcDNA3-VEGF(-);利用阳离子脂质体载体,稳定转染人喉癌Hep-2细胞,并通过流式细胞仪检测,观察转染细胞细胞周期的改变,在透射电镜下观察转染细胞超微结构的改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况。结果成功克隆了人VEGF基因,并构建了携带反义VEGF基因的真核表达载体pcDNA3-VEGF(-);将其稳定转染人喉癌Hep-2细胞,获得了稳定表达反义VEGF的细胞系,与正常Hep-2细胞相比,该细胞系细胞周期及超微结构均无明显改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,与对照组相比,肿瘤的生长速度明显减缓。结论反义VEGF基因转染可以有效地抑制喉癌的生长。

反义VEGF165腺病毒重组体的构建及鉴定

目的 :构建含人反义血管内皮生长因子 16 5 (VEGF16 5 )基因的重组腺病毒载体 ,为采用反义VEGF16 5RNA防治肿瘤的研究奠定基础。方法 :将人VEGF16 5cDNA反向插入到穿梭质粒pHCMVSP1A的CMV启动子之下 ,即pAd -ahVEGF16 5。后者与pJM17通过脂质体共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得含人反义VEGF16 5基因的重组腺病毒Ad -ahVEGF16 5。通过PCR共扩增法鉴别Ad -ahVEGF16 5的正确与否。根据 2 6 0nm的紫外光吸收值计算病毒滴度。结果 :VEGF16 5cDNA成功地反向插入了pHCMVSP1A载体 ,以重组病毒基因组DNA为模板 ,同时扩增出了5 76bp的反义VEGF16 5基因片段和 86 0bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了Ad -ahVEGF16 5的正确性。病毒滴度为5 .6× 10 11pfu/ml。结论 :成功构建了携带人反义VEGF16 5基因的腺病毒Ad -ahVEGF16 5 ,本研究为采用反义VEGFRNA途径治疗肿瘤的在体。

应用反义VEGF基因抑制肿瘤细胞生长的研究

本实验研究反义血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因对肿瘤细胞生长的抑制作用及由此引起的细胞凋亡。将pcDNA3.1/anti-VEGF真核表达载体转染人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y),采用软琼脂集落生长,MTT及电子显微镜观察细胞的增殖及形态学变化,并进一步从蛋白水平检测VEGF的表达。结果证明,反义VEGF基因确有抑制神经母细胞瘤生长的作用,电镜下观察到细胞出现凋亡形态,ELISA结果表明VEGF的表达显著降低。

反义VEGFcDNA转染联合应用IFNα或信号转导抑制剂571(STI571)对K562细胞的协同抑制

目的 :探讨转染反义VEGFcDNA及联合应用IFNα或STI571对慢性髓性白血病 (chronicmyeloidleukemia ,CML)急变细胞株K562的作用。方法 :利用转染反义 (AS)、正义 (S)VEGF1 2 1 cDNA及空载体 (V ,pcDNA3)的K562细胞株 ,采用台盼蓝拒染法、流式细胞术Annexin V FITC/PI双标技术 ,观察IFNα或STI571(CGP571 4 8B)对转染后K562细胞增殖及凋亡的影响。结果 :IFNα(1 0 0u·ml 1 )能抑制K562 /AS细胞生长 ,增加其凋亡。STI571 (0 .1 μmol·L 1 )对K562 /V、K562 /S和K562 /AS细胞生长均有抑制作用。低剂量VP1 6(1 0mg·L 1 )或低剂量STI571 (0 .1 μmol·L 1 )在 2 4h就对K562 /AS细胞有诱导凋亡的作用 ,且VP1 6(1 0mg·L 1 )与STI571(0 .1 μmol·L 1 )的联合应用具有协同诱导K562 /AS细胞凋亡的作用。在 72h时 ,0 .1 μmol·L 1 的STI571对K562 /V、K562 /S和K562 /AS细胞均有诱导凋亡的作用。结论 :转染反义VEGF1 2 1 cDNA联合应用IFNα能协同抑制细胞增殖 ,转染反义VEGF1 2 1 cDNA能增加K562细胞对VP1 6或STI571的敏感性。提示抗VEGF药物可能成为治疗CML的新策略。

腺病毒介导反义VEGF降低肿瘤诱导免疫抑制及增强IL-2的抗肿瘤效果

目的 :本研究旨在探讨腺病毒介导的反义VEGF降低肿瘤诱导的免疫抑制及增强IL 2的抗肿瘤效果。方法 :用反义VEGF修饰及反义VEGF与IL 2基因共同修饰MM45T .Li小鼠肝癌细胞 ,然后观察修饰后的肿瘤细胞的致瘤性 ;并在体内观察反义VEGF与IL 2基因诱导肝癌模型小鼠肿瘤细胞的凋亡 ,以及肿瘤组织中CD4+ ,CD8+ 细胞浸润情况。结果 :反义VEGF降低了肝癌细胞MM45T .Li的致瘤性 ;增加了肿瘤组织周围CD4+ ,CD8+ 细胞浸润 ,改善了模型小鼠的免疫抑制状态 ;提高了IL 2抗肿瘤效果。结论 :反义VEGF不仅可抑制新生血管的生成 ,而且可降低肿瘤诱导的免疫抑制 ,从而提高免疫系统对肿瘤细胞的识别 ,与IL 2免疫基因治疗相联合可明显提高对肿瘤的杀伤效果。

转染反义VEGF cDNA抑制K562细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成

目的 探讨转染反义血管内皮细胞生长因子 (VEGF)cDNA对慢性髓系白血病 (CML)急变细胞株K5 6 2裸鼠体内生长的影响。方法 利用转染反义 (AS)、正义 (S)VEGF1 2 1 cDNA及空载体 (V ,pcDNA3质粒 )的K5 6 2细胞株 ,观察转染细胞在裸鼠体内成瘤及生长情况 ;免疫组化法比较其裸鼠移植瘤微血管密度 (MVD) ;MTT法观察其对骨髓内皮细胞体外增殖的影响。结果 转染反义VEGF1 2 1 cDNA的K5 6 2 AS细胞组的瘤块体积小、生长慢于K5 6 2 V组 [(2 0 7.5± 192 .9)mm3 vs (4 45 .0± 15 0 .9)mm3 ,P <0 0 5 ],而K5 6 2 S组瘤块体积大于K5 6 2 V组 [(1174.6± 5 0 8.7)mm3 vs (4 45 .0± 15 0 .9)mm3 ,P <0 .0 1]。K5 6 2 AS组裸鼠体内肿瘤MVD低于K5 6 2 V组 [(11.0± 7.6 ) 0 .72mm2 vs (18.9± 7.0 ) 0 .72mm2 ,P <0 0 5 ],而K5 6 2 S组则高于K5 6 2 V组 [(5 0 .8± 11.7) 0 .72mm2 vs (18.9± 7.0 ) 0 .72mm2 ,P <0 .0 1]。K5 6 2 AS细胞的培养上清刺激骨髓内皮细胞增殖能力弱于K5 6 2 V ,而K5 6 2 S细胞的结果相反。结论 转染反义VEGF1 2 1 cDNA抑制K5 6 2细胞裸鼠体内肿瘤生长 ,降低裸鼠瘤块内MVD 。

反义VEGF基因抑制人胶质细胞瘤BT325生长的研究

目的研究反义VEGF基因对人胶质细胞瘤BT325生长的抑制作用及由此引起的细胞凋亡。方法构建含VEGF反义基因的真核表达载体pc DNA3.1/anti-VEGF(实验组),将其转染人胶质细胞瘤BT325,ELISA检测VEGF的表达。采用软琼脂集落生成,MTT以及电子显微镜观察胶质细胞瘤的增殖及凋亡等变化。结果与对照组相比,实验组VEGF的表达显著降低,几乎完全被抑制。与空载体组细胞集落生成数(21)相比,实验组细胞集落生成数(2)明显减少,胶质细胞瘤的生长受到明显的抑制,抑制率为38.23%,且电镜下实验组细胞出现明显的凋亡形态。结论反义VEGF基因通过抑制VEGF的表达抑制人胶质细胞瘤的增殖,促进细胞凋亡,发挥抗癌作用。

VEGF反义寡核苷酸抑制大鼠胶质瘤生长的时间与剂量的效应关系

目的在大鼠脑内原位注射反义寡核苷酸观察胶质瘤的生长抑制情况的时间与剂量的效应关系。方法所有大鼠均在立体定向导引下右尾状核区接种1×106C6胶质瘤细胞。不同时间和剂量VEGF反义寡核苷酸均在立体定向导引下原穿刺靶点注射。其中实验Ⅰ组在接种细胞的同时原位注射1000μmol/L的VEGF反义寡核苷酸,而实验Ⅱ组则同时注射2000μmol/L的VEGF反义寡核苷酸。对照Ⅰ组为对照。实验Ⅲ和Ⅳ组在细胞接种后的1和2周各原位注射1次,共2次,每次实验Ⅲ组为1000μmol/L、实验Ⅳ组为2000μmol/L的VEGF反义寡苷核酸。对照Ⅱ组为对照。实验V组仅在接种后2周注射1次2000μmol/L的VEGF反义寡核苷酸,并设对照Ⅲ组为对照。实验3周时处死所有的大鼠,解剖出全脑标本,观察肿瘤的生长情况,测量肿瘤大小。结果实验Ⅰ组的抑瘤率为94.5％,实验Ⅱ组的抑瘤率为100％。实验Ⅲ组的抑瘤率为91.5％,实验Ⅳ组为100％,实验Ⅴ组抑瘤率为87.8％。实验组和对照组的肿瘤体积比较有非常显著的差异。结论 原位应用VEGF反义寡核苷酸能取得很好的抗血管生成的治疗效果,抑瘤效果有明显的浓度依赖性。原位早期使用足量反义核酸能取得更好的效果。

VEGF反义RNA抑制裸鼠体内食管癌细胞生长的实验研究

目的探讨VEGF反义RNA对食管癌细胞在裸鼠体内生长的影响。方法观察转染VEGF反义RNA的食管癌细胞TE-1在裸鼠体内成瘤性;应用免疫组化法、RT-PCR法检测移植瘤组织中VEGF蛋白及mRNA表达和MVD;用流式细胞仪和透射电镜检测细胞凋亡情况。结果转染VEGF反义RNA的TE-1细胞在裸鼠体内肿瘤形成的潜伏期明显延长,所形成肿瘤的重量和体积小于对照组及空载体组。肿瘤组织中VEGF蛋白和mRNA的表达降低,MVD降低;肿瘤细胞发生明显的凋亡形态学改变;G0/G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,细胞增殖能力降低。结论VEGF反义RNA能抑制裸鼠体内TE-1细胞的生长,减少肿瘤内血管的生成,增加细胞凋亡;为食管癌的基因治疗提供了一定的实验依据。

反义血管内皮生长因子原位表达抑制白血病细胞系K562在裸鼠体内生长并诱导其凋亡

目的观察反义血管内皮生长因子(anti-VEGF)原位表达对白血病细胞系K562在裸鼠体内生长的影响。方法选用白血病细胞系K562裸鼠体内接种成瘤后,肿瘤内注射重组反义VEGF真核表达质粒及空载体和PBS,检测反义VEGF体内转染情况及其对肿瘤生长的影响;免疫组化法比较实验组和对照组移植瘤微血管密度(MVD)及白血病细胞的凋亡情况。结果注射反义VEGF表达质粒能抑制肿瘤的生长,使肿瘤的MVD显著降低(25.6±5.77VS41±3.8,P<0.05),并且使肿瘤细胞凋亡增加。结论肿瘤内注射反义VEGF重组表达质粒在体内能有效转染肿瘤及其周围组织,反义VEGF体内的表达能抑制白血病细胞肿瘤的生长,降低肿瘤内MVD,促进白血病细胞的凋亡。反义VEGF基因治疗策略提供了一种新的白血病辅助治疗方案。

血管内皮生长因子反义核酸增强华蟾素诱导K562细胞凋亡

目的研究VEGF反义核酸(ASON)增强华蟾素对人慢性粒细胞白血病K562细胞株诱导凋亡效应。方法合成VEGF ASON转染入K562细胞,4种浓度的华蟾素(1、3、5、7 mg/L)作用于K562细胞株24、48、72 h,应用West-ern blot法检测VEGF蛋白的表达,原位细胞凋亡(TUNEL)、流式细胞仪法(FCM法)检测细胞凋亡。结果不同剂量华蟾素组对K562细胞株均有抑制作用,并具有时间和浓度依赖性。经VEGF ASON转染的K562细胞株对华蟾素的诱导凋亡作用更加明显。结论华蟾素在体外一定浓度范围内可诱导K562细胞株凋亡,VEGF ASON可增强华蟾素诱导K562细胞凋亡的作用。

血管内皮生长因子反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用的研究

目的探讨VEGF反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用。方法用Lipofectamine介导的方法将VEGF反义eDNA转染入C6鼠胶质瘤细胞系,观察其对细胞增殖和凋亡的影响。结果在体外VEGF反义RNA可有效抑制C6鼠胶质瘤细胞内源性VEGFmRNA和VEGF蛋白的产生,但对细胞增殖和凋亡无明显影响。结论采用VEGF反义RNA可能成为抗血管形成肿瘤治疗的新策略之一。

血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制大鼠子宫内膜异位种植的实验研究

目的了解血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸对大鼠子宫内膜异位种植的抑制作用。方法用外科自体移植术建立SD大鼠右侧壁腹膜上子宫内膜异位症模型,在建模同时分别腹腔注射不同剂量的VEGF反义寡核苷酸(1 000μmol/L,2 000μmol/L)或生理盐水100μl,隔日1次,共4周。观察VEGF反义寡核苷酸对SD大鼠异位症建模成功率、移植物、在位内膜和卵巢的组织学变化及血清E2,P水平的影响。结果VEGF反义寡核苷酸腹腔注射使大鼠异位症模型的建模成功率明显降低,移植物体积均显著下降(P<0.01)。对照组建模成功的SD大鼠腹膜上的移植物囊肿内壁的上皮、固有膜以及固有膜的基质细胞、腺体样结构都和成熟大鼠的子宫内膜相似,移植物被覆的结缔组织及与其相连的腹膜表面都有丰富的血管形成。而用药组建模成功的SD大鼠移植物腔内面上皮不发达,固有膜较薄,固有膜的基质细胞、腺体样结构减少,移植物被覆的结缔组织及与其相连的腹膜血管稀少。各组血清E2,P水平差异无显著性(P>0.05)。结论VEGF反义寡核苷酸腹腔注射可以抑制大鼠子宫内膜的异位种植和生长,但不影响卵巢功能。