反义bcl-2基因逆转录病毒表达载体的构建

目的 克隆 bcl- 2基因 ,构建其不同反义核酸的逆转录病毒表达载体。 方法 设计一对两端带有Eco R 酶切位点的引物 ,RT- PCR克隆含 bcl- 2全部编码区的 848bp片段 ,并连接到 T载体 ,测序正确后正反向亚克隆到 p L XSN中 Eco R 位点 ;从 p Bluescript SK(- ) bcl- 2中用 Bam H 切下含有 bcl- 2阅读框起始部位的部分编码区亚克隆到 p L XSN Bam H 位点。 结果 构建带有正反向含 bcl- 2阅读框的全部编码区和部分编码区的逆转录病毒表达载体。 结论 在已知基因序列克隆中 ,联合 RT- PCR和 T载体是一个简单、快速、有效的方法 。

转染Zn^(2+)诱导表达反义bcl-2基因对人视网膜色素上皮细胞的影响

目的:观察转染Zn2+诱导表达的反义bcl-2 基因对人视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响。方法:培养的正常RPE细胞与转染反义bcl-2 RPE细胞采用免疫组化,克隆形成试验、MTT,流式细胞仪,TUNEL分别予以观察。结果:转染后RPE细胞细胞骨架角蛋白表达阳性;硫酸锌诱导表达的安全剂量为160μmol/L;诱导表达反义bcl-2 RPE大部分细胞bcl-2 表达为阴性,部分弱阳性;在第10d细胞克隆形成率分别为(4.65±0.043)%与(4.85±0.085)%(P >0.05),诱导表达反义bcl-2 的RPE生长曲线在5d后表现为低增生率(P <0.01);柔红霉素作用后G2期细胞由9.9%增加至30.4%;180μg/L柔红霉素作用反义bcl-2转染组TUNEL阳性细胞可见典型凋亡小体。结论:转染可诱导表达的bcl-2 基因的RPE细胞可以进行细胞凋亡的后续研究。