反义cyclinD1基因转染对人角膜基质细胞增生的影响

目的探讨反义cyclinD1基因转染后人角膜基质细胞增生的改变。方法人角膜组织来源于北京大学第一医院眼库体外培养人角膜基质细胞,采用第2代或第3代细胞用于实验。利用阳离子脂质体lipofectamine介导反义cyclinD1基因转染入体外培养的人角膜基质细胞。同时设非转染组(以PBS代替cyclinD1质粒及lipofectamine)及lipofectamine转染组(以PBS代替反义cyclinD1质粒)作为对照。应用免疫细胞化学法观察lipofectamine介导反义cyclinD1基因转染对人角膜基质细胞中cyclinD1蛋白表达的影响,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察其对人角膜基质细胞增生的影响,并用质量分数0.5%锥虫蓝染色观察活细胞比率。结果非转染组和lipofectamine转染组均有大量人角膜基质细胞的细胞核cyclinD1染色呈棕褐色,反义cyclinD1转染组只有少量人角膜基质细胞细胞核cyclinD1染色呈棕褐色。与非转染组和lipofectamine转染组比较,反义cyclinD1转染组在转染后2、6、10dcyclinD1蛋白在培养的人角膜基质细胞中的表达明显降低,差异均有统计学意义(t=6.050、t=5.180、t=5.040,P<0.01;t=6.190、t=5.670、t=5.010,P<0.01),而非转染组与lipofectamine转染组间比较,差异均无统计学意义(t=1.120、t=1.310、t=1.010,P>0.05)。转染后2、6、10d,反义cyclinD1转染组人角膜基质细胞的A570值分别低于非转染组和lipofectamine转染组,差异均有统计学意义(t=5.830、t=5.210、t=4.920,P<0.01;t=5.130、t=5.010、t=4.850,P<0.01),说明抑制了基质细胞的增生,而非转染组与lipofectamine转染组间比较,差异均无统计学意义(t=1.110、t=1.230、t=1.120,P>0.05)。0.5%锥虫蓝染色显示各组活细胞比率均在90%以上,未见明显的细胞毒性。结论阳离子脂质体介导的反义cyclinD1基因转染在转染后一定时间内可降低人角膜基质细胞中cyclinD1蛋白的表达,抑制人角膜基质细胞的增生,未见明显细胞毒性,为角膜基质过度愈合反应的基因治疗奠定了基础。

反义cyclinD1基因转染后人角膜基质细胞增生改变的实验研究

目的探讨反义cyclinD1基因转染对人角膜基质细胞增生的作用效果。方法从沈阳军区总医院眼库获取人角膜组织,体外培养获得第2代人角膜基质细胞用于实验。阳离子脂质体lipofectamine介导进行反义cyclinD1基因转染(实验组),对照组分别为PBS替代cyclinD1质粒及lipofectamine(对照1组)和PBS代替cyclinD1质粒(对照2组)。通过免疫细胞化学法统计人角膜基质细胞的cyclinD1蛋白表达情况,利用四甲基偶氮唑盐法分析人角膜基质细胞增生情况,锥虫蓝染色计算活细胞比率。结果反义cyclinD1转染后,人角膜基质细胞仅有少量细胞核cyclinD1染色呈阳性,cyclinD1蛋白表达明显降低,A570值显著下降,与对照1组和对照2组比较,差异存在显著性(P<0.05)。对照1组和对照2组比较,差异无显著性(P>0.05)。锥虫蓝染色显示3组活细胞比率均超过90%。结论反义cyclinD1基因转染具有抑制人角膜基质细胞增生的作用,并且细胞毒性不明显,可以作为基因治疗的相关依据。

肌萎缩侧索硬化SOD1基因治疗研究进展

肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)现有的治疗方式对减缓疾病进展效果有效。目前已发现多个ALS致病基因,使得通过基因技术修饰已知基因变异成为可能。超氧化物歧化酶1(SOD1)基因变异是所有ALS动物模型临床前研究和临床试验的主要靶点。目前,反义寡核苷酸、RNA干扰、使用针对错误折叠蛋白的抗体消减或利用DNA基因组编辑技术修正变异基因等针对SOD1基因变异进行了较多研究,其中反义寡核苷酸治疗已上市,其他治疗研究也取得较大进展。

血清长链非编码RNA生长阻滞特异性基因6反义RNA1与冠状动脉粥样硬化病变程度及稳定性的相关性

目的检测冠状动脉粥样硬化(CAS)患者血清长链非编码RNA生长阻滞特异性基因6反义RNA1(lncRNAGAS6-AS1)的表达水平,分析其与CAS病变程度及稳定性的关系。方法选取2020年2月至2021年8月期间在武汉市汉口医院接收的124例CAS患者为CAS组,同期在我院体检的健康者124例为对照组;检测并比较各组血清中lncRNAGAS6-AS1和白介素-6(IL-6)的表达水平,分析CAS患者血清lncRNA GAS6-AS1与IL-6表达水平、Gensini积分的相关性。结果与对照组相比,CAS组血清lncRNA GAS6-AS1的表达水平降低,IL-6表达水平升高(t=43.614、23.404,P<0.05);稳定性、不稳定性心绞痛和急性心肌梗死患者中lncRNA GAS6-AS1表达水平依次降低,IL-6表达水平依次升高(F=6.821、7.495,P<0.05);单支、双支、多支病变患者血清lncRNAGAS6-AS1表达水平依次降低,IL-6表达水平依次升高(F=12.946、13.023,P<0.05);轻、中、重度病变组血清lncRNA GAS6-AS1表达水平依次降低,IL-6表达水平依次升高(F=15.900、6.224,P<0.05);CAS患者血清lncRNAGAS6-AS1与IL-6表达水平和Gensini积分呈负相关(r=-0.685、-0.699,P<0.05)。结论CAS患者血清lncRNA GAS6-AS1表达水平可能可以作为反映CAS病变严重程度和稳定性的潜在生物标志物。

长链非编码RNA配对盒基因8反义RNA1在恶性肿瘤中的研究进展

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的RNA转录本。配对盒基因8反义RNA1(PAX8-AS1)是lncRNA的一种,在甲状腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、急性白血病、肾上腺皮质癌等多种恶性肿瘤中异常表达,通过作为竞争性内源RNA和其单核苷酸多态性等机制调节癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和耐药性,对癌症的诊断、治疗及预后具有非常重要的价值。本文就lncRNA PAX8-AS1在恶性肿瘤中的作用机制及潜在应用进行综述。

LncRNA RUNX1-IT1对恶性多形性腺瘤miR-195/CyclinD1的调控作用探讨

目的 :探讨恶性多形性腺瘤(malignant pleomorphic adenoma, MPA)细胞中长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)RUNX1-IT1对微小RNA-195(microRNA-195, miR-195)/细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的调控作用。方法:收集手术切除的MPA组织及癌旁组织,检测LncRNA RUNX1-IT1、miR-195、CyclinD1 mRNA的表达水平,分析三者与MPA临床病理的关系。培养MPA细胞系SM-AP1,转染阴性对照(NC)siRNA、LncRNA RUNX1-IT1 siRNA、miRNC、miR-195抑制物,检测细胞增殖水平A490及miR-195、CyclinD1的表达水平,分析LncRNA RUNX1-IT1靶向miR-195、miR-195靶向CyclinD1的关系。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果 :MPA中LncRNA RUNX1-IT1、CyclinD1的表达水平显著高于癌旁组织,miR-195的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05)。LncRNA RUNX1-IT1与miR-195呈负相关、与CyclinD1呈正相关,miR-195与CyclinD1呈负相关。肿瘤直径≥3 cm、复发、远处转移的MPA癌组织中,LncRNA RUNX1-IT1、CyclinD1表达更高(P<0.05),miR-195表达更低(P<0.05)。敲低LncRNA RUNX1-IT1后,SM-AP1细胞的A490水平、CyclinD1表达水平降低,miR-195表达水平增加(P<0.05)。LncRNA RUNX1-IT1通过直接靶向作用于SM-AP1细胞中的miR-195,miR-195通过直接靶向作用于SM-AP1细胞中的CyclinD1。抑制miR-195后,敲低LncRNA RUNX1-IT1降低A490水平及CyclinD1表达水平的作用减弱(P<0.05)。结论:LncRNA RUNX1-IT1可能通过调控miR-195/CyclinD1表达,参与MPA的发生、发展。

p16、CyclinD1、Cdk4、Rb基因在胰腺癌中的表达及其意义

目的：探讨ｐ１６ 、 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、 Ｃｄｋ４ 、 Ｒｂ 在胰腺癌中的作用及其相互关系。方法：免疫组织化学检测ｐ１６ 、 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、 Ｃｄｋ４ 、 Ｒｂ 蛋白在胰腺癌中的表达，原位杂交检测ｐ１６ 和 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 在胰腺癌中的存在状况。结果：ｐ１６ 在胰腺癌中低表达， Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 和 Ｃｄｋ４ 过度表达，未发现 Ｒｂ 在胰腺癌标本中缺失；ｐ１６ 与 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１，ｐ１６ 与 Ｒｂ 呈负相关关系（ Ｐ＜ ０．０５） ， Ｃｄｋ４ 与 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 呈正相关关系（ Ｐ＜ ０ ．０５） 。结论：胰腺癌发生机制涉及ｐ１６ 、 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、 Ｃｄｋ４ 和 Ｒｂ 调节环路中多个基因的异常，ｐ１６ 低表达和 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 过度表达可能起在胰腺癌发生中起协同作用。

GRP1.8融合反义4CL1基因调控烟草木质素生物合成

该研究成功地将从刺槐 (Robiniapseudoacacia)中克隆得到的定位于形成层表达的GRP1 8启动子 ,分别与GUS报告基因及从毛白杨 (Populustomentosa)中克隆的香豆酸连接酶 (4CL1)基因连接构建成GRP1 8 GUS和GRP1 8 anti 4CL1融合基因 ,转基因于烟草植物 .经组织化学检测分析 ,GUS基因成功地由GRP1 8启动子驱动定位于形成层表达 ;融合基因GRP1 8 anti 4CL1的表达明显地改变了转基因烟草植株的木质素和纤维素的含量和比例 .转基因烟草的木质素含量较对照平均降低了 13 7% ,而转基因植株的纤维素含量较对照升高了 15 6 % .

人NHE-1基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的 构建人Na+ H+ 交换蛋白 1(Na+ H+ exchanger 1,NHE 1)基因反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术 ,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶从NHE 1cDNApEAP切下所需目的片段 ,然后将该片段反向插入真核表达载体pcDNA3 1( ) Zeo的多克隆位点 ,最后对产生重组子进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,将目的片段成功的连接到pcDNA3 1( ) Zeo载体上。结论 成功地将NHE 1目的片段反向插入到pcDNA3 1( ) Zeo中 ,构建了人NHE 1反义表达真核载体hNHE 1。

转反义LeETR1基因番茄采后生理特性的研究

转反义LeETR1乙烯受体基因番茄的采后生理性状与普通番茄不同。转基因番茄的呼吸作用受到抑制 ,呼吸高峰只有对照的 5 2 % ,乙烯释放高峰的出现比对照果实推迟 10d。转基因番茄的叶绿素降解和番茄红素的合成受到显著抑制 ,果实不能形成正常的红色。在成熟过程中 ,转基因番茄的纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶活性显著低于对照 ,延缓了果肉的软化。

ZNRD1基因的克隆及其反义核酸对胃癌耐药细胞阿霉素蓄积的影响

为获得ZNRD1基因的编码区序列 ,构建反义真核表达载体 ,通过检测ZNRD1基因反义核酸转染对胃癌长春新碱耐药细胞SGC790 1/VCR阿霉素 (ADM)积蓄能力的影响 ,评价ZNRD1在抗胃癌细胞多药耐药性方面的应用前景。用PCR方法扩增目的基因序列 ,PCR产物经DNA序列测定证实后 ,采用分子克隆技术 ,将所获目的基因全长cDNA片段按反方向克隆入真核表达载体pcDNA3 1+ 的多克隆位点之间 ,对重组质粒进行酶切鉴定。用脂质体介导法将ZNRD1反义核酸转染SGC790 1/VCR ,流式细胞仪 (FACS)检测SGC790 1/VCR细胞内阿霉素的蓄积量。结果应用PCR反应扩增出特异性片段 ,经DNA序列分析 ,证实与文献报道的ZNRD1基因编码区序列一致 ;构建了反义真核表达载体pcDNA3 1 ZNRD1;转染SGC790 1/VCR细胞后 ,可提高细胞内ADM蓄积量。ZNRD1反义核酸转染后 ,胃癌多药耐药细胞株SGC790 1/VCR对抗肿瘤药物ADM的积蓄作用提高 ,提示ZNRD1反义核酸具有提高耐药细胞株细胞内药物浓度、恢复其药物敏感性、逆转多药耐药性的作用。

癌基因蛋白cyclinD1、p21 ras在大肠癌和腺瘤组织中的表达

为探讨ｃｙｃｌｉｎＤ１与ｐ２１ｒａｓ癌基因蛋白表达失调在大肠癌发生机制中的作用并尝试以ｃｙｃｌｉｎＤ１作为大肠癌早期诊断的肿瘤标记，本研究用免疫组化法检测大肠良、恶性病变中ｃｙｃｌｉｎＤ１和ｐ２１ｒａｓ蛋白的表达，现报道如下。１材料和方法１．１材料收...

乳腺癌中抑癌基因PTEN与cyclinD1的表达及意义

目的 研究乳腺良性、恶性病变中抑癌基因PTEN及细胞周期调控因子cyclinD1的蛋白表达及临床病理特征的关系。方法 应用免疫组织化学S P法检测 2 3例癌旁正常乳腺组织、2 8例乳腺增生组织 (其中 2 0普通型增生 ,8例非典型增生 )、8例导管原位癌、98例浸润性乳腺癌组织PTEN和cyclinD1蛋白的表达 ,并进行微血管密度计数。 结果 非典型增生上皮和导管原位癌的PTEN蛋白水平高于正常乳腺腺上皮 (P <0 0 1) ;浸润性癌组织中PTEN高表达率为4 9 0 % ,与正常乳腺组织比较差异有显著性 (P <0 0 5 ) ,与增生的乳腺组织和导管原位癌组间差异无显著性。浸润性乳腺癌中PTEN的表达与分级、腋淋巴结转移、TNM分期、微血管密度计数均呈负相关 ,与cyclinD1蛋白表达呈负相关 ,PTEN表达低下时乳腺癌中cyclinD1蛋白的高表达率与腋淋巴结受累、组织学分级呈正相关 ,PTEN高表达时cy clinD1蛋白的高表达率与腋淋巴结受累、组织学分级无关。结论 PTEN与细胞周期调控因子cyclinD1表达的改变是乳腺癌发生的早期事件 ,共同参与乳腺癌的发生。PTEN的表达水平低下可作为乳腺癌分化和转移的一个潜在的生物学标志。CyclinD1对乳腺癌分化和腋淋巴结转移的影响可能部分受到PTEN的调控。

胃癌中survivin、PTEN、cyclinD1和p53基因的表达及其相关性

目的 探讨survivin基因表达与胃癌生物学行为及PTEN、cyclinD1、p5 3和凋亡指数 (AI)的相关性。 方法 用免疫组化EnVision法检测 15 6例胃癌组织、4 6例正常胃黏膜和 4 6例癌旁不典型增生组织中survivin、PTEN、cyclinD1和 p5 3的表达以及AI。结果 survivin、PTEN、cyclinD1和p5 3的阳性检测率分别为 6 5 %、4 1%、6 1%和 5 8%。survivin未见核内表达。survivin、cyclinD1和 p5 3表达与胃癌的组织学类型相关 (P <0 0 1,P <0 0 5和P <0 0 1) ;survivin和cyclinD1表达与胃癌的浸润深度相关 (P <0 0 1和P <0 0 5 ) ;4种基因蛋白表达均与淋巴结转移相关 ,survivin的表达与p5 3和cyclin阳性表达呈正相关 ,与PTEN的阳性表达呈负相关 ;survivin、p5 3和cyclinD1高表达均有患者术后 <3年生存期相关 (P <0 0 5 ,P <0 0 1和P<0 0 1) ;survivin阳性组的平均AI为 0 6 1,明显低于survivin阴性组 (P <0 0 1) ;PTEN阳性组明显高于阴性组 (P <0 0 1)。结论 survivin、PTEN、p5 3和cyclinD1基因在胃癌的发生、发展中起着不同程度的作用 ,它们的检测对胃癌恶性度的判定、预后和进一步治疗提供有效的依据。survivin、p5

LeETR1反义基因对番茄的遗传转化

从番茄果实中提取总RNA,根据GeneBank中LeETR1序列,设计合成特异性引物,利用RT-PCR技术克隆了LeETR1基因3’端非编码区313 bp的cDNA,经酶切图谱和序列分析鉴定无误后,反向插入到植物表达载体pPZP111A中,构建了表达LeETR1反义RNA的双元载体。经农杆菌途径转化番茄品种B1后,通过PCR检测从抗卡那霉素再生植株中筛选到13株阳性植株,Southem blot杂交确证反义基因已经整合到番茄染色体中。对果实乙烯释放的测定结果表明,转基因番茄乙烯释放高峰的出现比对照果实推迟10天,番茄红素的合成受到显著抑制,果实不能形成正常的红色。推测LeETR1和番茄的成熟有着密切的关系。

根癌农杆菌介导反义fad2-1基因转化大豆的研究

通过根癌农杆菌介导法将反义fad2-1基因导入大豆子叶节,研究了农杆菌菌液浓度、预培养时间、共培养时间、恢复培养时间、乙酰丁香酮浓度和pH值对大豆子叶节形成丛生芽的影响,建立了有效的转化体系,获得了转基因大豆再生植株。PCR、PCR-Southern blotting检测结果表明,反义fad2-1基因成功转入并整合于大豆基因组。GC检测结果表明,转反义fad2-1基因大豆种子油酸含量比非转基因大豆种子的油酸含量提高了14.44%,而亚油酸含量降低了20.27%。

C-erbB-2与c-raf-1基因反义寡核苷酸联合对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用

背景与目的:针对c-erbB-2与c-raf-1单基因的反义寡脱氧核苷酸(antisenseoligodexynucleotide,ASODN)治疗肿瘤的研究报道很多,这些研究往往局限于单个基因或细胞水平,从肿瘤发生的多基因学说上讲是不恰当的。本研究旨在探讨c-erbB-2与c-raf-1基因联合ASODN对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用。方法:在BALB/c裸鼠上建立卵巢上皮癌模型,然后随机分成阴性对照组和6个实验组(分别为脂质体c-erbB-2SODN组、脂质体c-raf-1SODN组、脂质体c-erbB-2ASODN组、脂质体c-raf-1ASODN组、全剂量联合反义给药组、半剂量联合反义给药组)。检测裸鼠体重及肿瘤体积变化,计算抑瘤率及肿瘤缩小率。结果:给药后,全剂量联合反义给药组与半剂量联合反义给药组的肿瘤体积抑瘤率分别为72.5%和78.4%,肿瘤重量抑瘤率分别为70.7%和75.3%,肿瘤缩小率分别为29.7%和41.6%。在给药后,各组裸鼠体重变化无明显统计学差别。结论:C-erbB-2与c-raf-1基因联合ASODN在体内能明显地抑制肿瘤生长。

cyclinD_1、Rb基因蛋白在乳腺癌中的表达

目的：探讨ｃｙｃｌｉｎＤ１基因及Ｒｂ基因的表达与乳腺癌发生发展的关系。方法：应用ＡＢＣ免疫组化法检测２４例良性乳腺组织及５８例乳腺癌中ｃｙｃｌｉｎＤ１及Ｒｂ蛋白表达。结果：乳腺癌中ｃｙｃｌｉｎＤ１过表达阳性率５８．６２％（３４／５８）显著高于良性乳腺组织中的１６．６７％（４／２４），Ｐ＜０．０５。ｃｙｃｌｉｎＤ１过表达出现于导管原位癌并持续于浸润、转移等进展过程中，与年龄、肿瘤大小、组织学类型及淋巴结状态无相关性，但与组织学分级负相关。乳腺癌中Ｒｂ蛋白表达阳性率为３６．２％（２１／５８），显著低于良性乳腺组织的７５％（１８／２４），Ｐ＜０．０５；未见Ｒｂ失表达与临床病理参数间存在相关性，Ｒｂ表达与ｃｙｃｌｉｎＤ１过表达呈正相关。结论：ｃｙｃｌｉｎＤ１过表达及Ｒｂ失表达是乳腺癌发生中的重要事件且前者是一早期分子事件；ｃｙｃｌｉｎＤ１过表达发挥作用可能部分依赖于Ｒｂ蛋白的存在；提示细胞周期调控异常参与乳腺癌的发生。

转反义OsRACK1基因增强水稻抗旱能力

RACK1是一种多功能支架蛋白,广泛参与植物生长发育过程的调节。利用反义RNA技术抑制水稻(Oryza sativa)RACK1基因的表达,分析了RACK1基因在响应干旱胁迫中的功能。采用实时定量PCR对获得的转基因植株的RACK1基因表达进行分析,结果表明转基因水稻RACK1基因表达受抑制程度达到50%左右。与非转基因水稻(对照)相比,转基因水稻耐干旱能力强,膜脂过氧化程度低且丙二醛的含量少,SOD活性高。这些结果表明,RACK1蛋白负调节水稻对干旱胁迫的耐受过程,并且这种调节作用在很大程度上与植株体内的氧化还原系统有关。

转反义vp1基因水稻再生苗的获得及分子鉴定

应用超级双元载体和农杆菌介导转基因技术 ,试图将反义vp1基因引入到容易穗萌的保持系冈 46B和容易诱导愈伤组织的籼稻品种R893与容易转化的粳稻品种粳 16中 ,结果冈 46B获得再生苗 41株 ,R893获得再生苗 43株 ,粳 16获得再生苗 2 6株。经PCR检测 ,仅粳 16中有 2株携带潮霉素抗性基因 ,其中 1株携带反义vp1基因 ;冈 46B和R893中未能获得转基因再生苗。