细胞核内反义RNA和反义ribozyme-基因表达抑制新途径

细胞核内反义ＲＮＡ和反义ｒｉｂｏｚｙｍｅ－基因表达抑制新途径张德礼高步先高显明邓柏林朱关福１北京军区后勤部卫生防疫队、北京军区兽医防治中心北京１０００７１；１中国军事医学科学院微生物流行病学研究所北京１００８５０关键词细胞核反义ＲＮＡ反义ｒｉｂｏｚｙ...

细胞核内反义RNA和反义ribozyme——基因表达抑制新途径

近年来,新采用的反义技术已有细胞核内反义RNA和Antizyme。前者是指将反义RNA限制于细胞核内抑制靶基因原始转录子,以避免在细胞浆需抑制极其巨大数量的靶RNA,而起到把问题解决在萌芽状态的独特作用,这种模拟真核生物天然存在反义RNA封闭基因表达机制的高效方法,无疑开辟了一条抑制基因表达的新途径。后者是反义ribozyme,即ribozyme基因与反义RNA基因相连接,转录成具有ribozyme和反义RAN双重功能的一类RNA分子,实际上是基因剪刀和基因表达封条的联合体。目前,它在转基因植物研究方面,应用比较广泛。从研究进展、存在问题、发展对策和应用前景四方面评述细胞核内反义RNA和反义ribozyme是抑制基因表达的新途径。

抗c-erbB-2 ribozyme的计算机设计

目的:设计能特异性切割人癌基因c-erbB-2 mRNA的核酶(ribozyme).方法:根据Symons的“锤头结构”,以人癌基因c-erbB-2 mRNA为靶RNA,用计算机对其可能为核酶切割的位点进行分析以寻找最佳切点;对底物及核酶的二级结构进行预测.结果:c-erbB-2mRNA第2428～2776位和第2820～3004位之间的二级结构相对稳定,是重要的生物学功能区,因而也是核酶理想的攻击区域.该区第2438,2477,2751位是核酶的最佳切割位点.针对这三个位点设计了三个核酶并分别命名为RZ1,RZ2,RZ3.计算机模拟显示,它们均能与底物切点两翼碱基结合而形成锤头状结构.通过计算机基因库检索,在已知人基因中,其它基因的mRNA均不含有上述三个核酶切点两翼碱基的同源序列.结论:并非所有的GUX或CUX均可作为核酶的理想切割位点,c-erbB-2mRNA上第2438,2477,2751位可能是核酶的最佳切割位点.

Ribozyme和靶RNA的相互作用对于切割反应的影响

锤头结构Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（Ｒｚ）通过与靶ＲＮＡ上切卢、二狈帕５核普酸序列的碱基配对识别和切割靶ＲＮＡ。通过改变Ｒｉｂｏｚｙｍｅ与靶ＲＮＡ之间碱基配对的长度以及性质，研究了Ｒｉｂｏｚｙｍｅ与靶ＲＮＡ相互作用对于它的切割反应的影响。结果表明：（１）缩短碱基配对长度和改变碱基配对的性质，使Ｒｉｔｉｏｚｙｍｅ与底物的熔卢、（Ｔｍ）降低，同时反应最适温度（Ｔｏｐｔ）也降低。（２）动力学分析表明，反应的Ｋｍ值随温度升高而增加，当温度接近或高于Ｒｉｂｏｚｙｍｅ与底物的熔点时，Ｋｍ值增加大大加快。（３）反应的Ｋｃａｔ也随温度升高而增加，但Ｋｃａｔ增加的速度继而逐渐变慢，最后Ｋｃａｔ下降。

目的Ribozyme两侧长片段附加序列（LAS）的去除及其转录载体构建

选择小鼠腺苷脱氨酶ｍＲＮＡ特异Ｒｉｂｏｚｙｍｅ做为目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（Ｒｚ），在目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ两侧分别设计５＇－顺式Ｒｚ和３＇－顺式Ｒｚ，在目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ上设计ＢａｍＨＩ酶切位点，并构建了上述Ｒｉｂｏｚｙｍｅ转录载体ｐＳＣＲｚ２６２，采用该质粒进行体外转录，并对转录靶ＲＮＡ分子进行了切割反应。结果显示ｐＳＣＲｚ２６２在转录过程中发生了自身切割，并释放出目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ－Ｒｚ２６２，该目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ不但去除了两侧长片段附加序列，而且保持了正确的生物学活性，通过ＢａｍＨＩ切点的设计简化了该质粒的筛选。

抗HPV16 E7-ribozyme在CV-1细胞中的稳定表达

构建了由RSV-LTR启动子带动并能在细胞内稳定复制的Ribozyme的自身修剪表达质粒pRSV-Rz523、Ribozyme反义对照质粒pRSV-AE7及人增殖细胞核抗原基因(PCNA)启动子带动的HPV16 E7片段(+554～+686)的真核表达质粒pPCNA-E7。经G418抗性筛选获得了稳定表达Ribozyme的CV-1细胞克隆,其表达水平约为9.0pmol/10~6个细胞,其中活性Ribozyme的量大于50fmol/10~6个细胞,分离得到的Ribozyme可在体外特异切割E7靶RNA片段。通过共转染Ribozyme(或反义对照)和底物表达质粒并筛选出细胞克隆,研究了Ribozyme在细胞中对底物表达水平的影响。初步结果显示,Ribozyme的导入可使细胞内底物E7的RNA表达水平降低了90％(反义对照使E7 RNA表达降低20％)。上述结果提示:在CV-1细胞中表达的Ribozyme不仅在体外,同时在细胞内具有一定的生物学活性,有可能应用于逆转宫颈癌细胞的恶性表型。

抗猪瘟病毒Ribozyme基因表达载体的构建

根据猪瘟病毒（ＨＣＶ）基因组ＲＮＡ的序列和Ｒｉｂｏｚｙｍｅ的结构特点，设计并合成了针对ＨＣＶ基因组Ｐ（８０）编码区长为５６碱基对（ｂｐ）的榔头状ＨＣＶＲｉｂｏｚｙｍｅ（ＨＲ）基因。将此基因插入质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中，转化ＸＬ１－ｂｌｕｅ细胞，经限制性内切酶鉴定，获得６个阳性克隆ｐＢＨＲ。可用于ＨＣＶ抗性的体外表达研究。又将羊金属巯因启动子（ｏＭＴ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ）插入ｐＢＨＲ，构建重组质粒ｐｏＭＨＲ，经序列分析插入的ＨＲ基因序列和方向与设计相符。再将ｏＭＴＨＲ基因插入质粒ｐｍＭＴ中，最终构成ｐＭＨＲ表达载体，经酶切分析和聚合酶链式反应（ＰＣＲ）鉴定表为此表达载体中确含ｏＭＴ启动子和ＨＣＶ－Ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因，可用于ＨＣＶ抗性的体内表达研究。

bcl-2核酶(Ribozyme)促进紫杉醇诱导的细胞凋亡

用核酶技术阻断或降低抗凋亡蛋白 Bcl- 2的表达以促进化疗药物紫杉醇诱导的食管癌细胞凋亡 ,探索克服耐药、提高紫杉醇疗效的新途径 .将特异性切割 Bcl- 2 m RNA的核酶克隆至含MTII启动子并可为 Zn SO4 诱导表达的真核表达载体中 ,通过脂质体转入食管癌鳞状上皮细胞系Eca 1 0 9中 ,经 G41 8筛选得到稳定抗性细胞株 X1 0 9R,挑取单细胞株扩大培养 ,1 40μmol/L Zn SO4诱导 3d,用 Northern- blot、免疫荧光、流式细胞仪鉴定核酶及 Bcl- 2蛋白表达情况 ,用 TUNEL标记及流式细胞术检测凋亡细胞的比例 .bcl- 2核酶在不同单细胞株中有不同程度的表达 ,其中一株X1 0 9R1 4表达最高 .测定其中 Bcl- 2蛋白含量 ,发现 Bcl- 2蛋白表达大为降低 .加入紫杉醇后 ,TUNEL标记及凋亡峰测定结果都表明同一条件下凋亡率升高 .结果提示 ,转入特异性切割 bcl- 2m RNA的核酶可有效地阻断 Bcl- 2蛋白合成 .Bcl- 2蛋白表达降低可明显促进紫杉醇诱导的细胞凋亡 .说明 Bcl-

切割MDR1 RNA的核酶(Ribozyme)对肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/DOX化疗耐药性的逆转作用

为逆转肿瘤多药耐药基因(MDR1)产物P-gp蛋白所介导的肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受性,设计合成了一种能切割MDR1 mRNA第196密码子GUC序列的锤头状核酶(Ribozlyme)并定向克隆于转录病毒载体pDOR-neo的BamH Ⅰ位点.经病毒包装细胞PA317包装后感染人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/DOX细胞,经G418筛选得到稳定的转化细胞株.Northem Blot杂交证实包装细胞PA317及转化的BEL-7402/DOX细胞中均有病毒的高表达,RT-PCR证实转化细胞中MDR1 mRNA与未转化细胞相比明显减少甚至不能扩增出来,流式细胞技术检测转化细胞P-gp的表达与非转化细胞的93.4～97.5%相比下降至8.2～14.6%.MTT法检测证实转化细胞对多种化疗药物重新产生较高的敏感性.结果表明,表达Ribozyme的逆转录病毒载体转化肝癌多药耐药细胞BEL-7402/DOX后能有效抑制MDR1的表达和翻译,使已产生耐药的肿瘤细胞的多药耐药表型发生逆转.

RNA研究进展之一:Ribozyme

Cech和Altman因发现酶活性RNA(Ribozyme)而获得1989年诺贝尔化学奖。本文重点介绍Ribozyme的应用研究。现在已知的Ribozyme绝大部分参与RNA的加工和成熟。它们可以分为四类。(1).

抗HPV16E7－ribozyme的体外制备与活性鉴定

通过体外转录结合乙醇沉淀，建立了体外大量制备抗ＨＰＶ１６Ｅ７－Ｒｚ的方法。切割实验表明，ｒｉｂｏｚｙｍｅ可在体外准确和有效地切割Ｅ７靶ＲＮＡ，形成８５ｎｔ和８６ｎｔ大小的切割产物。体外制备的ｒｉｂｏｚｙｍｅ的切割活性、Ｋｍ和ｋｃａｔ值与人工合成的相似。结果说明，体外制备的ｒｉ－ｂｏｚｙｍｅ具有特异的催化切割活性。

Prion是病毒吗?——兼谈ribozyme的中文定名

在中文定名中， 把ｐｒｉｏｎ 定为朊病毒或与病毒有关的名称均不恰当， 不应在定名上动摇“病毒”的原有定义． 同样， 也不应把ｒｉｂｏｚｙｍｅ 定为与酶有关的中文名， 以避免冲击酶的传统概念． 我们赞同把ｐｒｉｏｎ 定名为蛋白感染子； 把ｒｉｂｏｚｙｍｅ 定名为ＲＮＡ 催化剂．

Ribozyme研究现况与展望

Ｒｉｂｏｚｙｍｅ研究现况与展望祁国荣（中国科学院上海生物化学研究所，上海２０００３１）关键词Ｒｉｂｏｚｙｍｅ近年来，ｒｉｂｏｚｙｍｅ研究进入一个平稳发展阶段，没有太大的突破。关于ｒｉｂｏｚｙｍｅ在体内阻断基因表达和抗病毒的前景，能否用作临床药物，还难...

Ribozyme——分子病毒学的新领域

Ribozyme是具有催化RNA切割反应功能的RNA,它可以有效地序列特异性地切割RNA。最近,Ribozyme的一般结构已经被证实,因此能够设计并人工合成Ribozyme,通过切割破坏RNA,阻断其功能,并抑制基因表达,包括抑制病毒的基因表达,从而有效地阻止病毒的复制和繁殖。这是近年来继反义RNA之后发现的又一个抑制基因表达的有力工具,它开辟了分子生物学的一个新领域,具有很大的潜在应用价值,因此它一出现即引起各国学者的极大兴趣。

核糖核酸和焦炭酸二乙酯修饰影响ribozyme切割活性的初步研究

以抗HPV16E7－ribozyme作为研究模型，对影响ribozrme切割活性的一些因素进行了初步探讨。结果发现，核糖核酸（RNA）可以明显影响ribozyme的体外切割活性，且其活性随着加入反应的RNA量和RNA种类的不同而异，细胞内的RNA可能会明显影响ribozyme的体内切割活性。另外，ribozyme的焦炭酸二乙酯修饰也可明显影响ribozyme的切割活性，说明ribozyme保守序列中的腺苷酸（A）对其活性的维持是重要的。

小鼠腺苷脱氨酶mRNA特异Ribozyme计算机设计

小鼠腺苷脱氨酶ｍＲＮＡ经计算机分析，包括：ｒｉｂｏｚｙｍｅ切点位置选择，二级结构预测，基因生物学功能和基因同源性分析，筛选出四个锤头结构ｒｉｂｏｚｙｍｅ．结果表明上述ｒｉｂｏｚｙｍｅ底物切点两翼碱基形成发夹结构，切点位于单链环区，切点所在基因片段位于该基因生物功能区内，并同已知小鼠其它基因不同源．

Ribozyme与基因表达

Ribozyme指一类具有生物催化功能的RNA,也称RNA催化剂、在化学本质上,它不同于具有生物催化功能的蛋白质——酶(enzyme),Ribozyme发现于80年代初,近十年来,ribozyme研究进展深化了生物催化理论,提出了生物大分子和生命起源的新概念。

酶活性RNA（Ribozyme）的发现及其认识论

酶活性ＲＮＡ是一类具有携带遗传信息和催化作用双重功能的ＲＮＡ分子，这一发现打破了“酶的本质是蛋白质”的传统观念。利用Ｒｉｂｏｚｙｍｅ所进行的基因干预和基因治疗展现出重要的实用价值。这一事实告诉我们科学实验是科学发展的动力，是检验真理的标准，科学的发展永无尽头，人类的认识没有止境。

Ribozyme的结构及其化学修饰

本文对四种类型Ribozyme的结构进行了综述,并着重讨论了锤头型Ribozyme的化学修饰及对其稳定性和催化活性的影响。

Ribozyme在疾病治疗中的应用

Ribozyme具有催化切割其他RNA分子的能力,不少研究者针对这一特点,试图通过人工设计的Ribozyme破坏致病的RNA分子,在爱滋病、慢性肝炎和癌症等疾病的治疗上做了大量探索性的工作,对存在的许多问题提出了相应的解决方法。这方面的研究预示着Ribozyme在临床治疗上的应用前景。