反刍月形单胞菌乙酸生成缺陷株的构建及相关酶活性分析

[目的]构建反刍月形单胞菌乙酸生成的缺陷株并分析其发酵特性。[方法]应用转座子标签法,通过转座子供体菌E.coliS17-1/pZJ25∷Tn5对受体菌反刍月形单胞菌进行转座子诱变,采用含卡那霉素和氟乙酸纳的选择性培养基筛选接合子。[结果]共筛选出稳定的对卡那霉素和氟乙酸具有抗性的转座工程菌7株。对反刍月形单胞菌的突变株进行16S rRNA鉴定和Tn5的PCR鉴定,及乙酸激酶(AK)和磷酸乙酰转移酶(PTA)酶比活力分析,确定突变株属于pta基因缺失型氟乙酸抗性菌株。[结论]该研究为进一步研究反刍兽瘤胃微生物乙酸的细胞代谢网络和调控奠定基础。

用CODEHOP设计简并引物克隆反刍月形单胞菌K6乙酸激酶基因片段

利用CODEHOP设计细菌乙酸激酶的简并引物,选用1对引物ACKSe以高效丙酸生成菌反刍月形单胞菌K6基因组DNA进行PCR,得到749 bp PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,测序后经Blastx比对,此DNA产物与其他菌属来源的乙酸激酶蛋白序列具有相似性,所克隆的序列即为K6的乙酸激酶基因片段。用CODEHOP程序化设计的简并引物可信性强,阳性率高。该基因的成功克隆为丙酸生成菌K6乙酸代谢工程研究提供了依据。

奶牛瘤胃中反刍兽月形单胞菌的分离鉴定

采用厌氧分离技术从奶牛瘤胃中分离出1株细菌,通过对其形态、培养特性、生理生化特性、16SrRNA基因序列测定与同源性分析等研究,确定分离菌株为反刍兽月形单胞菌(Selenomonas ruminantium),为进一步研究其对瘤胃发酵的影响奠定了基础。

反刍兽月形单胞菌β-木糖苷酶基因在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质

β-木糖苷酶(β-xylosidase,酶编号EC 3.2.1.37)是木聚糖降解酶系中的重要组成部分。本研究以毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主菌尝试表达反刍兽月形单胞菌Selenomonas ruminantium中的β-木糖苷酶基因Sxa。根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、mRNA二级结构、GC含量和稀有密码子,对Sxa基因进行优化;通过基因合成技术获得了全长基因mSxa并构建重组酵母表达载体pPIC9K-mSxa;以BglⅡ酶切重组载体pPIC9K-mSxa,电击转化将m Sxa基因导入毕赤酵母GS115中,获得的转化子经过表型和遗传霉素G418抗性筛选、PCR鉴定,得到表达β-木糖苷酶基因的工程菌GS115-pPIC9K-mSxa;通过活性测定获得高效表达β-木糖苷酶的重组酵母,并对重组β-木糖苷酶的酶学性质进行了初步研究。结果表明,重组β-木糖苷酶的分子量约为66 kDa。在发酵罐水平表达的酶活性达到了287.61 IU/mL。对酶学性质研究显示,该酶在温度为40-60℃,pH为5.0-7.0时较稳定,其最适反应温度和pH分别为55℃和6.0,专一性地作用于β-木糖苷键。Mn^(2+)和Ca^(2+)对该酶具有激活作用,而Fe^(3+)、Cu^(2+)、Co^(2+)、Mg^(2+)、EDTA及SDS抑制其酶活性。本研究首次将反刍兽月形单胞菌的β-木糖苷酶基因转化到毕赤酵母中获得表达,并具有较高活性,为进一步工业化应用奠定了基础。

Construction of Deficient Strain by Selenomonas ruminantium Mutant with the Acetic Acid and Analysis on Its Related Enzyme Activity

[Objective]The research aimed to construct deficient strain generated by Selenomonas ruminantium mutant with the acetic acid and analyze its fermentation characteristics.[Method]Based on the transposon tagging method,Selenomonas ruminantium（recipient strain）was carried out the transposon mutagenesis via the transposon donor strain E.coli S17-1/pZJ25∷Tn5.The zygote was screened by using the selective medium which included kanamycin and sodium fluoroacetate.[Result]Seven transposon engineered strains which had the stable resistance to kanamycin and fluoroethanoic acid were screened.Selenomonas ruminantium mutant was carried out 16S rRNA and Tn5 PCR identification.Moreover,the specific activities of AK and PTA were analyzed.The mutant belonged to fluoroethanoic acid resistance strain with pta gene deficiency.[Conclusion]The research laid the foundation for further studying the cellular metabolic network and regulation of acetic acid in rumen microorganism of ruminant animal.