植物功能基因组学研究技术及其在林木中的应用

介绍了近年来植物功能基因组学研究技术包括表达序列标签、基因表达的系列分析、DNA微阵列、反向遗传学的发展及其在植物,特别是在林木中的应用进展。

ISTR标记在榧树种质资源遗传多样性分析中的应用

利用反向序列标签重复技术(inverse sequence-tagged repeat,ISTR)对43份安徽省榧树种质资源及3份浙江省榧树资源进行了遗传多样性分析。ISTR能很好地用于榧树种质资源遗传多样性分析,多态性比例为87. 09%,46份榧树种质遗传相似系数为0. 548 4～1. 000 0,表明安徽省榧树种质资源遗传多样性较为丰富。采用UPGMA(非加权组平均算法)对46份种质的ISTR数据进行聚类分析,结果显示可分为3个类群,来自同一地方的种质基本上都独立聚成类群,表明种质间亲缘关系与地理来源关系较为密切;相似的种质类型聚为一类,可能与实生繁殖方式有关。ISTR标记可在榧树种质资源遗传多样性分析中被广泛地应用。

人胚胎干细胞和分化细胞差别基因的筛选

人类胚胎干细胞 (humanembryonicstemcell,hESC)在增殖过程中如何保持未分化状态是干细胞生物学的核心问题之一 ,已有的LIF通路、Oct 4因子及Nanog基因的作用还不能对这一问题做出全面的解释。为进一步了解维持hESC未分化状态的机制 ,采用自行建立培养的hESC及分化的hESC细胞克隆 (differentiatedhESC ,dhESC) ,应用抑制消减杂交 (SuppressionSubtractiveHybridization ,SSH)结合反向cDNA斑点杂交技术 ,筛选出在hESC高表达、在dhESC中低表达或不表达的表达序列标签 (ExpressedSequenceTag,EST)共 10 5个。通过与GenBank比较 ,显示其中76个EST代表 6 1个已知基因 ,18个EST代表 15个假想基因 ,另有 11个属于未知EST。选取其中 8个克隆进行半定量RT PCR分析 ,证实其中 7个克隆在hESC中高表达 ,在dhESC中低表达或不表达。结果表明 ,hESC分化前后涉及多个基因的差异表达 ,对这些在hESC中高表达、在dhESC中低表达或不表达基因的进一步功能研究为阐明维持hESC未分化状态的机制提供了基础。

辣椒多态性EST-SSR标记开发及连锁图谱构建

采用SSR检索程序,从辣椒221 037条unigenes中筛选到17 319个SSR位点,设计了10 468对引物,并对其进行E-PCR多态性检测。结果表明,1 538对引物具有多态性,其中554条辣椒EST序列能匹配到番茄基因组上,构成了12条辣椒EST-SSR连锁群,平均每条连锁群含45.75个EST-SSR。对匹配到番茄基因组上的EST-SSR进行GO(gene ontology)分类,结果有481条EST序列被分类,其中以初生代谢、细胞代谢、生物合成过程为主,分别占34.13%、28.35%、25.82%。在KEGG map中,91条EST序列共涉及到76条代谢途径(KEGG),约67条序列参与新陈代谢途径,32条序列参与次生代谢产物合成途径。

香蕉果实采后抑制差减文库的构建与鉴定

抑制差减杂交技术(suppressionsubtractivehybridization,SSH),是抑制PCR与差减杂交技术相结合而产生的。其优点是在差减杂交过程中使不同丰度cDNA的拷贝数差异趋于均衡,因此不同丰度的差异表达基因都能得到有效克隆,能有效分离低丰度的差异表达基因,避免了表达序列标签分析中高丰度基因重复测序的缺点。因此SSH技术被应用于植物差异表达基因的分离。香蕉果实采后成熟过程中发生一系列复杂的生理变化,这些变化涉及到许多基因的表达。为了研究香蕉果实采后与采前在基因表达上的差异,我们首次采用抑制缩减文库的方法,以分离香蕉果实在采后表达的基因。以采后0h的香蕉果实cDNA为驱动子,对香蕉果实采后48h果实cDNA为待测子,进行抑制缩减杂交,抑制缩减杂交产物与pGEM-TEasyVecter连接,转化E.coliDH5琢,构建了抑制缩减文库。该文库共包含312个克隆,采用PCR方法对文库进行了重组子的鉴定,共有302个重组子。该文库的构建成功为深入研究香蕉果实采后基因的表达奠定了基础,为研究香蕉果实采后成熟的分子生物学机理提供了一个新的思路。

ISTR在部分柿属植物种质鉴定和亲缘关系分析中的应用

利用反向序列标签重复技术(inverse sequence-tagged repeat,ISTR),对柿属7个种,包括柿(Diospyros kaki Thunb.)、君迁子(D.lotus L.)、浙江柿(D.glaucifolia Metc.)、油柿(D.oleifera Cheng.)、金枣柿(D.sp.)、老鸦柿(D.rhombifolia Hemsl.)和美洲柿(D.virginiana L.)共32个基因型进行了种质鉴定和亲缘关系研究。结果表明:ISTR可区分供试柿属植物中的30份;ISTR能够很好地适用于柿属植物亲缘关系分析;供试的中国与日本原产柿种质分别聚类;新发现的中国甜柿变异类型与日本甜柿的亲缘关系较远且存在较丰富的遗传变异,可能是潜在的育种资源。ISTR标记可在柿属植物种质资源鉴定和亲缘关系分析中更广泛地应用。

人乳头状瘤病毒16型E7基因重组腺相关病毒载体的构建及E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达

目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒pAAVMCSE7、含rep/cap基因的质粒pAAVRC及辅助质粒pAAVhelper共同转染胚胎肾细胞系HEK293细胞,回收、纯化病毒颗粒并鉴定,斑点杂交法测定病毒滴度,RTPCR技术、蛋白印迹法验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。结果电镜鉴定结果显示真核细胞中有病毒颗粒存在,斑点杂交法测定病毒滴度为1×1011/ml。含HPV16E7基因的rAAV载体转染真核细胞后,在细胞内可检测到HPV16E7mRNA和蛋白的表达。结论本实验成功构建了含HPV16E7基因的rAAV载体,经验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞内有表达。

广西莪术EST-SSR标记开发及其在遗传多样性分析中的应用

目的:分析姜黄表达序列标签(EST)中简单重复序列(SSR)位点的分布特点,开发近缘种广西莪术EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于进行广西莪术遗传多样性分析及分子育种的可行性。方法:下载NCBI中公布的姜黄EST 12 678条,利用SSR-FINDER搜索SSR位点,筛选符合条件的序列,采用Primer 5.0设计SSR引物,挑选30个表现型差异较大的广西莪术种质进行引物有效性及多态性检测,对50份广西莪术种质进行遗传多样性分析。结果:12 678条EST序列含有SSR位点1 243个,其中二核苷酸出现频率为50.36%,三核苷酸31.54%,四核苷酸10.30%,以AT/TA和CT/GA出现频率最高。利用Primer 5.0设计引物共325对,聚合酶链式反应(PCR)检测表明,104对引物可以扩增出理想PCR产物,在至少30份不同种质广西莪术中检测到48对SSR引物具有多态性,占设计引物的38.09%。遗传多样性分析研究,聚类分析结果表明50份广西莪术种质在相关系数0.7处,聚类为2类,遗传相似性系数变化范围较窄。结论:姜黄EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR标记开发效率较高。本研究开发了48对广西莪术EST-SSR标记,并筛选出富含SSR位点的候选序列,用聚类图验证了植物之间的亲缘关系,为广西莪术遗传多样性分析和分子育种研究提供参考。