膜反向斑点杂交法检测广东人G6PD基因6种常见突变

【目的】探讨膜反向斑点杂交法在广东人G6PD基因6种常见突变同步检测中的应用。【方法】用高铁血红蛋白还原试验和G6PD/6-PGD酶活性比值法进行G6PD缺乏症筛查。应用多重PCR方法扩增G6PD基因目的片段。用Premier Primer6.0软件设计和优化针对广东人常见6种G6PD基因突变型的特异性寡核甘酸探针,用乙基-3-二甲氨基丙碳二亚胺(EDC)法处理尼龙膜并固定探针,制成G6PD基因突变检测用膜条。多重PCR扩增产物与固定在膜条上寡核苷酸探针进行杂交,通过显色反应判读结果。以G6PD基因测序为金标准,对膜反向斑点杂交法进行评价。【结果】26例标本中膜反向斑点杂交法检测结果:95A→G突变型5例,1024C→T突变型3例,1376G→T突变型8例,1388G→A突变型7例,392G→T突变型1例,未发现1311C→T突变型,有两例检测为阴性。膜反向斑点杂交法未能测出的2例标本经基因测序证实存在392G→T突变,其余24例膜反向斑点法与基因测序法的结果完全一致,符合率为92.3%(24/26)。【结论】在优化探针设计和杂交条件前提下,膜反向斑点杂交法可用于广东人G6PD基因6种常见突变型的同步检测。

反向斑点杂交法快速检测肺炎支原体

目的:探讨早期、快速检测肺炎支原体的方法。方法:根据肺炎支原体特异的P1基因设计引物,通过聚合酶链反应合成一段特异的162bp长链DNA探针,采用反向斑点杂交法检测生物素标记支原体DNA,并应用于痰标本的检测。结果:所合成的162bpDNA探针具有高度特异性,只和肺炎支原体杂交,与其它细菌、真菌、病毒无交叉反应,该探针最低可检测出1ng的DNA。杂交法和培养法分别检测100份痰标本,两者的阳性率分别为12%和2%。结论:该方法快速、特异,对肺炎支原体的早期诊断具有较高的应用价值。

反向斑点杂交法检测流感嗜血杆菌核酸

目的 探讨早期、快速检测流感嗜血杆菌的方法。方法 应用流感嗜血杆菌编码外膜蛋白特异的P6基因设计引物 ,通过聚合酶链反应合成特异探针 ,采用反向斑点杂交法检测生物素标记DNA ,并应用于痰标本的检测。结果 只有流感嗜血杆菌扩增出 35 1bp的DNA片段 ,该探针能检测出 10ng的细菌DNA ,与其他细菌、病毒、真菌无交叉反应。该方法和培养法分别检测 5 0份痰标本 ,两者的阳性率分别为 30 %和 2 2 %。结论 该方法快速、特异 。

应用PCR-反向斑点杂交法快速检测和鉴定医学重要真菌

目的 建立一种以PCR为基础的的检测和鉴定医学重要真菌的方法。方法 将白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、都柏林念珠菌和新型隐球菌的种特异性探针加尾后固定于硝酸纤维素膜上 ;用标记生物素的真菌通用引物扩增经提取的各真菌DNA ,与固定在膜上的探针杂交。结果 所用的真菌通用引物可扩增12种临床常见的真菌DNA ,扩增片段长度在 35 0bp左右。 8种特异性探针分别与上述真菌PCR扩增产物杂交 ,结果表明 8种探针具有高度的特异性。通过 39例临床标本和 2 5例临床分离菌株的检测 ,PCR -反向杂交法与真菌培养法的结果基本一致 ,且鉴定时间也由传统培养鉴定方法约需 1周的时间缩短至 2天。结论 该方法可快速、正确地将 8种临床常见真菌鉴定到种水平 ,如经大量临床标本的检测验证 ,可望在临床微生物实验室开展。

PCR荧光法与PCR-反向斑点杂交法检验人乳头瘤病毒比较观察

目的观察比较PCR-反向斑点杂交法(PCR-RDB)与PCR荧光法在HPV(人乳头瘤病毒)中的检验效果。方法选择我院2011年1月至2014年1月收集的女性宫颈脱落细胞样本共251例,分别行PCR-RDB检测和PCR荧光法对HPV进行检测,比较两种方法检测结果。另将两种方法检测8种HPV结果均显示为阳性的患者设为观察组,其余患者设为对照组,病理检测作判定标准,比较组间阳性率。结果 PCR荧光法检测阳性率为36.65%(92/251);PCR荧光法检测阳性率为40.24%(101/251);两种方法检测8种高危HPV一致率为79.68%(200/251),观察组行TCT检测和组织病理活检结果 ,病变率为42.31%(22/52)。对照组病变率为10.77%(14/130)。两者相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PCR-RDB检测和PCR荧光法在HPV检测中具有较好的一致性,采用高危型HPV检测能有效筛查宫颈癌。

反向斑点杂交技术检测HPV基因分开型在宫颈癌筛查中的应用

目的探讨反向斑点杂交法(RDB)检测人乳头瘤病毒(HPV)基因分型,作为宫颈癌筛查手段的临床意义和价值。方法采用反向斑点杂交法检测23个HPV基因型别低危型:(HPV6、11、42、43、45)和高危型:(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4)。结果683例样本中检出HPV阳性者196例,检出率为28.69%,低危型占30.10%、高危型占54.04%、二型和二型以上混合感染占17.85%。结论持续的HPV感染与宫颈疾病的演变有关,反向斑点杂交法能较好地检出HPV感染的基因型,为临床提供较有价值实验资料,对宫颈病筛查有较大的帮助。

反向点杂交法检测中国人N-乙酰化酶基因型

目的 建立快速方便的反向点杂交法 (RDB)检测中国人N 乙酰化酶 (NAT2 )基因型。方法 采用PCR法扩增生物素标记的DNA片段 ,与固定在尼龙膜上的等位基因特异性寡核苷酸探针进行杂交 ,通过非同位素法显色检测杂交结果 ,分析NAT2 5种主要突变位点。用本法对 4 8名肺结核患者NAT2基因型进行了分析。结果 RDB法与等位基因特异扩增法结果完全一致。 4 8名肺结核患者NAT2 5、 6、 73种突变型等位基因的基因频率分别为 1 0 4 %、2 2 9%和 15 6 %。野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子分别为 33 3%、5 4 2 %和 12 5 %。结论 RDB法检测NAT2基因型准确、方便 ,适用于指导临床合理用药。

建立一种反向斑点杂交法检测肺炎支原体23S rRNAV区A2063G基因突变的方法

目的建立检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)23S rRNA V区2063基因型的反向斑点杂交方法,并与PCR产物直接测序法的结果进行比较分析。方法19例自临床咽拭子标本分离培养的MP,用自行设计的反向斑点杂交法检测23S rRNA V区2063基因型,同时对相应序列测序分析。抽提标准菌株FH和127份经PCR测定MP阳性的临床标本基因组DNA,用MP阴性的基因组DNA抽提物5份作阴性对照,用反向斑点杂交法检测23S rRNA V区2063基因型。结果19例分离培养的MP,经反向斑点杂交法检测15株有23S rRNA V区基因A2063G位点突变;4株为2063A,与测序结果一致(Kappa一致性检验,P>0.05)。经反向斑点杂交法检测,127份MP阳性的基因组DNA抽提物中有122份标本为A2063G位点突变,标准菌株FH和2份DNA抽提物的2063位点碱基为A,还有3份抽提物标本的2063位点碱基既有A又有G,5份阴性对照均无显色。结论反向斑点杂交方法能快速、准确检测临床MP 23S rRNA V区2063基因型。

聚合酶链反应-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种

目的 建立一种简便、快速、敏感和特异的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法 以 16SrDNA为靶序列 ,采用聚合酶链反应 (PCR) 反向斑点杂交检测 2 5种分枝杆菌、11种非分枝杆菌标准株、10株分枝杆菌临床分离株和 2 6份临床痰标本。结果 分枝杆菌、非分枝杆菌标准株经DNA扩增 ,分枝杆菌均出现 5 78bpDNA片段 ,非分枝杆菌除假白喉棒状杆菌可见同样片段外 ,其余菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出 10 0fg结核分枝杆菌DNA。探针特异性试验表明 ,17种寡核苷酸探针除pTub1、pFor1、pSme探针可见交叉杂交外 ,其余探针均是特异的。 10株结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌临床分离株PCR 反向斑点杂交结果与常规鉴定结果相符。 2 6份涂片阳性痰标本经该法直接鉴定为结核菌复合体。结论 16SrDNAPCR 反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种快速、有效 ,具有较高的应用价值。

反向斑点杂交技术应用于人乳头瘤病毒基因分型的研究

人乳头瘤病毒（HPV）感染、传播是宫颈癌与尖锐湿疣发生的重要病因，且HPV多重感染是宫颈癌的一个极其重要的危险因素。目前，已经确定的HPV型别有100多种，其中42种与生殖道疾病有关，不同地区HPV感染类型有较大差异。本研究利用反向斑点杂交法，可同时检测23种HPV型别，包括18种高危型与5种低危型。

血红蛋白电泳法在β地中海贫血诊断中的应用

目的探讨血红蛋白电泳法在β地中海贫血诊断中的应用效果。方法选取2018年4—11月于河南省直第二医院就诊的贫血患者359例为研究对象,所有患者均接受血红蛋白电泳法及聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCR-RDB)检测。以PCR-RDB检测结果为“金标准”,分析血红蛋白电泳法在β地中海贫血疾病中的诊断灵敏度、特异度及准确度。结果359例贫血患者中,经PCR-RDB检测确诊β地中海贫血87例;血红蛋白电泳法诊断灵敏度为98.85%(86/87)、特异度为72.43%(197/272),准确度为78.83%(283/359)。结论血红蛋白电泳法在β地中海贫血诊断中具有较高的诊断灵敏度,可为β地中海贫血疾病早期诊疗提供有效的依据。

武汉地区儿童β地中海贫血基因突变类型分析

目的 探讨武汉地区儿童β地中海贫血致病基因分布情况。方法 选择2013年1月至2015年1月在武汉市妇女儿童医疗保健中心就诊的经血细胞分析筛选出的疑似β地中海贫血患儿274例，其中男性178例，女性96例；年龄6个月 ～ 14岁，平均年龄为2.83岁。采集乙二胺四乙酸二钾盐（EDTA）抗凝静脉血，提取白细胞DNA，采用PCR寡核苷酸探针反向斑点杂交法（PCR-RDB）进行β地中海贫血基因检测，对基因突变位点和基因型进行分析。结果 274例β地中海贫血初筛患儿中确诊152例，检出率为55.47 %（152/274）。共检出9种等位基因突变，分别为IVS-2-654、CD41-42、CD17、CD43、CD71-72、CD27-28、-28、-29、CD26；3种最常见的突变位点IVS-2-654、CD41-42、CD17分别占到全部等位基因突变的43.81 %（85/194）、23.20 %（45/194）、12.89 %（25/194）。共检出26种β地中海贫血基因型，9种单纯杂合子110例（占72.37 %，110/152），13种双重杂合子36例（占23.68 %，36/152），4种纯合子6例（占3.95 %，6/152）。结论 β地中海贫血是武汉地区贫血患儿的重要原因之一；武汉地区β地中海贫血患儿以IVS-2-654位点的突变最为常见。

西安地区男性尿道感染人乳头瘤病毒基因亚型分析

目的探讨西安地区男性尿道感染人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)基因亚型特点。方法采用PCR-反向斑点杂交法(reverse dot hybridization assay,RDB)检测2015~2016年陕西省人民医院皮肤科478例男性尿道分泌物中18个HPV基因型,低危型HPV包括HPV6,11,43和高危型HPV包括HPV16,18,31,33,35等亚型。结果 478例受检者中HPV感染率为44.98%(215/478),单一HPV亚型、两种HPV亚型、三种HPV亚型、四种HPV亚型和五种HPV亚型的感染率分别为32.85%(157/478),8.79%(42/478),2.09%(10/478),0.42%(2/478)和0.84%(4/478);低危型HPV亚型和高危型HPV亚型累计检出率分别为40.17%和22.38%,其中检出率前五位HPV亚型为HPV6(24.69%),HPV11(12.13%),HPV16(5.65%),HPV43(3.35%)和HPV52(2.30%),其他亚型检出率介于0%~2.09%;在同年龄段受检者中HPVs感染模式均以单一感染为主;21岁以上的受检者中主要HPV亚型(HPV6,11,16,43,52和66)检出率差异均有统计学显著性意义(X^2=12.879~109.7,P=0.000~0.025)。结论西安地区男性尿道感染的HPV亚型以HPV6,11,16,43和52为主,为研究男性感染HPV的流行病学提供数据和资料。

深圳市宝安区妇女人乳头瘤病毒感染现状及影响因素分析

目的：了解深圳市宝安区女性宫颈人乳头瘤病毒（HPV）感染及基因分型情况，探讨影响HPV感染的相关因素，为本地区更有效地开展宫颈癌防治提供依据。方法：采用聚合酶链式反应一反向斑点杂交法（PCR—RDB）对2015年1～12月自愿参加宫颈癌筛查的1652例女性进行23种HPVDNA检测，同时对筛查对象的一般情况进行问卷调查。结果：1652例筛查对象中，HPV阳性266例，阳性率为16．10％，其中61例为混合型感染。高危型HPV感染最常见的亚型为HPV52、HPV16亚型，低危型HPv感染最常见的亚型为HPV43亚型。单因素分析结果示：年龄、户籍类型、文化程度、家庭经济收入、初次性行为年龄、初产年龄、怀孕次数、性伴侣数、伴侣性伴侣数为HPV感染的影响因素（P〈0．05）。多因素非条件Logistic回归分析结果表明：家庭经济收入、初次性行为年龄、怀孕次数、性伴侣数为影响HPV感染的危险因素（P〈0．05）。结论：HPV感染多见于家庭月平均收入低，初次性行为年龄早，怀孕次数多，性伴侣数多的女性人群，应重视对此类人群的筛查。

延安市乙型肝炎病毒基因型分子流行病学研究

目的了解延安市乙型肝炎病毒(HBV)的基因型流行及分布情况,探讨HBV基因型与其预防治疗的临床意义。方法采用反向杂交(RDB)技术对延安市122份HBVDNA阳性血清进行基因分型。结果在随机选取的122例HBVDNA阳性患者中,可检出基因型121例,检出率是99.18%,其中C型116例。C基因型患者的年龄、ALT水平及HBVDNA载量与B、D基因型没有显著性差异(P>0.05)。C基因型患者不同临床型之间HBsAg、HBsAb、HBcAb水平上比较没有显著性差异(P=0.170,0.280,0.418),但HBV携带状态组其HBeAg水平显著高于慢性乙型肝炎组(P=0.000),且在HBeAg、HBeAb和HBV-DNA水平与肝炎肝硬化组比较具有显著性差异(P=0.000,0.000,0.000);慢性乙型肝炎组在HBeAg、HBeAb和HBV-DNA水平上与肝炎肝硬化组比较也具有显著性差异(P=0.005,0.001,0.009)。男女性别在年龄及HBVDNA含量上比较均没有显著性差异(P=0.587,0.081),但在ALT水平上比较具有显著差异(P=0.015)。C基因型在年龄≥35岁组中所占的比例(97.83%)高于其在年龄<35岁组中的比例(94.67%),但差异无统计学意义(P=0.390)。结论延安市乙型肝炎病毒基因型有基因型B、C、D和B/C型,其中基因型C为优势基因型。

赣南地区孕期妇女ɑ、β地中海贫血分子流行病学回顾性分析

目的回顾性分析赣南地区孕期妇女ɑ、β地中海贫血基因类型及分布。方法采集475例孕期妇女外周血,通过PCR-反向斑点杂交法,分析缺失型ɑ-、突变型ɑ-和突变型β-地中海贫血基因类型。结果赣南地区孕期妇女ɑ、β地中海贫血基因总携带率为60.80%,缺失型ɑ-地中海贫血基因携带率为39.68%,突变型ɑ-地中海贫血基因携带率为1.26%,突变型β-地中海贫血基因携带率为17.89%,ɑ、β复合型地中海贫血基因携带率为2.32%。其中缺失型ɑ-地中海贫血以--^(SEA)/ɑɑ、-ɑ^(3.7)/ɑɑ、-ɑ^(4.2)/ɑɑ为主,占总缺失型的95%以上;突变型ɑ-地中海贫血以ɑɑ/ɑ^(QS)ɑ为主,占总突变型的66.67%以上;β-地中海贫血主要的几种突变类型为IVS-Ⅱ-654、CD41/42、-28、CD17、CD27/28,占β-地中海贫血的90%。结论赣南地区孕期妇女地中海贫血携带率较高,以缺失型ɑ-地中海贫血基因的检出为主,为该地区孕期妇女开展遗传咨询和产前诊断等提供指导。

非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测分析

目的了解非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血(简称地贫)基因突变的类型,为临床预防地贫重症患儿的出生提供指导。方法选择钦州地区980例高危人群的样本检测3种非缺失突变型α-地贫(HbCS,HbQS,HbWS)。非缺失突变型α-地贫采用反向斑点杂交法。结果非缺失突变型α-地贫50例,占5.10%;CS/11例;WS/9例;QS/5例;CS/--SEA 20例、WS/--SEA 3例、wQS/--SEA 1例、CS/-3.7 1例;检出非缺失α地贫复合β地贫8例,占0.82%。结论初步阐明非缺失α-地贫的基因突变类型和构成比,提高α-地贫的检出率,为非缺失型α-地贫的基因检测提供了必要性。