应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌耐乙胺丁醇基因型的研究

应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对乙胺丁醇 (EMB)耐药性。设计与合成用于检测结核分支杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针 ,点于硝酸纤维素膜上 ,与结核分支杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应 (PCR)产物进行反向斑点杂交 ,并与PCR 单链构象多态性 (PCR SSCP)和PCR 直接测序 (PCR DS)结果比较。对 81株结核分支杆菌临床分离株进行分析 ,31株EMB敏感株中 ,2 6株embB基因的SSCP图谱、膜反向斑点杂交结果与标准株 (H37Rv)完全相同 ;其余 5株SSCP图谱出现泳动变位 ,其中 3株E1b杂交阳性 ,PCR DS分析为embB基因 30 6位密码子ATG→GTG突变 ;2株E1d杂交阳性 ,PCR DS分析为embB基因 30 6位密码子ATG→ATA突变。 5 0株耐EMB菌株中 ,2 4株PCR SSCP图谱与标准菌株相同 ,E1杂交阳性 ;2 6株PCR SSCP图谱出现泳动变位 ,其中 18株E1b杂交阳性 ,2株E1c杂交阳性 ,5株E1d杂交阳性 ,1株E1e杂交阳性 ,未发现E1f杂交阳性 ,与PCR SSCP、PCR DS分析结果一致。突变检出率为 5 2 %。膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分支杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。

膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因型

目的应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇(EMB)耐药性。方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上,与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交,并与PCR-直接测序(PCR-DS)结果比较。结果27株结核分枝杆菌临床分离株中,14株敏感株膜反向斑点杂交结果与标准株完全相同;13株耐乙胺丁醇临床分离株检测到embB基因突变,均为306位密码子ATG→GTG、ATG→CTG、ATG→ATA、ATG→ATT和ATG→ATC突变,该突变与直接测序结果完全一致。结论膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。

膜-反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌

目的探讨膜-反向斑点杂交技术(RDB)在病理石蜡组织和肺泡灌洗液检测结核杆菌的临床应用价值。方法以97例病理石蜡组织、97例肺泡灌洗液为研究对象,分别以膜-反向斑点杂交、实时荧光PCR(RT-PCR)、抗酸染色三种方法检测结核杆菌,对三种方法进行方法学评价。结果结核组病理石蜡组织、肺泡灌洗液三种方法检测的总阳性率分别为:抗酸染色为32.8%,RT-PCR阳性率为82.8%,RDB阳性率为89.9%,两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05),对照组三种方法检测结果均为阴性;三种结核杆菌的检测方法的方法学评价,RDB灵敏度(90.6%)、约登指数(0.91)、符合率(93.9%)、阴性预测值(85.0%)均较好。结论膜-反向斑点杂交技术在病理石蜡组织和肺泡灌洗液结核杆菌的检测上有很高的临床应用价值,值得临床推广应用。

膜反向斑点杂交技术在结核分枝杆菌耐药突变株中的检测应用

本文通过对膜反向斑点杂交中各杂交条件的摸索,旨在建立一种快速检测katG、rpoB基因突变的膜反向斑点杂交技术。通过验证该技术成功的验证了膜反向斑点杂交技术在检测结核分枝杆菌耐药性上的应用价值。本实验首先应用PCR技术扩增结核分枝杆菌的katG、rpoB耐药基因,然后用膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌的耐药基因,最后将膜反向斑点杂交技术方法的结果与DNA测序结果相比较,进而验证此方法的准确性。通过对实验结果的分析,表明膜反向斑点杂交技术准确的检测了结核分枝杆菌的耐药性,其结果与DNA测序结果的符合率为100%。从而可以得出结论:膜反向斑点杂交技术可以其简便、快速、灵敏、特异的方式直接检测结核分枝杆菌的katG、rpoB基因突变,可以为临床检测结核分支杆菌的耐药性提供辅助诊断手段。

不同检测方法对肺结核患者肺泡灌洗液中结核杆菌的诊断价值

目的:探讨不同检测方法对肺结核患者肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中结核杆菌的诊断价值。方法:收集2013年1月至2015年12月在长沙市中心医院住院的100例患者的BALF,其中临床确诊为肺结核患者65例,另选取35例作为对照,分别应用BALF涂片法、聚合酶链反应(PCR)、膜-反向斑点杂交技术(reverse dot blot,RDB)同步检测肺结核杆菌。结果:BALF涂片法,PCR检测,RDB法对结核杆菌诊断阳性率依次为43.08%,73.84%,92.31%,3种检测方法阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。BALF涂片法灵敏度、特异度、符合率、阴性预测值分别为43.08%,88.57%,59.00%,45.59%;PCR检测分别为73.85%,100.00%,83.00%,67.31%;RDB法分别为92.31%,100.0%,95.00%,87.50%。结论:RDB法不仅能准确诊断结核杆菌,且能快速、简单地分辨肺结核杆菌耐链霉素(SM)、利福平(RFP)、异烟肼(INH)基因型,具有较高的临床应用价值。

肺结核患者肺泡灌洗液中结核杆菌检测的方法学评价

目的探讨不同检测方法对肺结核患者肺泡灌洗液(BALF)中结核杆菌的诊断价值。方法收集100例患者的BALF,其中临床确诊为肺结核患者65例设为结核组,余下的35例非肺结核患者作为对照组,分别应用BALF涂片法、聚合酶链反应法(PCR)、膜-反向斑点杂交技术(RDB)进行同步检测肺结核杆菌。结果BALF涂片检查法对结核杆菌的诊断阳性率为43.08%,PCR为73.84%,RDB为92.31%,3种检测方法阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。BALF涂片法敏感度、特异度、符合率、阴性预测值分别为43.08%、77.14%、36.00%、17.78%,PCR分别为73.85%、100.00%、83.00%、67.31%,RDB分别为92.31%、100.0%、95.00%、87.50%。结论 RDB不仅能准确诊断结核杆菌,且能快速、简单地分辨肺结核杆菌耐链霉素、利福平、异烟肼基因型,具有较高的临床应用价值。

SAT联合RDB技术检测结核耐药性及其应用价值研究

为了评估SAT联合RDB方法在快速诊断肺结核及耐药性检测中的应用价值,采集216例疑似肺结核患者以及30例非肺结核患者的痰样本,分别对它们进行抗酸染色镜检、Bactec MGIT960快速液体培养与药敏检测以及SAT检测,另外,对106例样本进行RDB检测,统计与分析方法学特点。结果显示,Bactec MGIT960快速液体培养与SAT方法的阳性率分别为50.0%与62.%,灵敏度分别为47.1%与65.7%,特异性为71.4%与100%;而相较于Bactec MGIT960药敏检测,RDB方法的灵敏度、特异性与符合率分别为77.8%、95.5%与92.4%;10例Bactec MGIT960药敏检测结果为耐福利平,采用RDB方法,检测出rpoB基因位点突变。由此可知,SAT技术在MTB检测方面简便而快捷,有利于临床肺结核诊断阳性率与灵敏度的提高,采用RDB技术,则可进行MTB耐药性的快速筛查,两者联合,在快速诊断肺结核疾病并检测其耐药性方面有重要的应用价值。

基于PCR-RDB的地中海贫血基因复合型检测方法的临床应用

目的探讨基于PCR结合反向斑点膜杂交技术(PCR-RDB)的地贫基因复合型检测方法的准确性、稳定性、临床应用优势及前景。方法收集165份已知不同地贫基因型和地贫阴性血液标本,采用基于PCR-RDB的地贫基因复合型检测方法进行检测;另外与现有临床地贫基因分开检测的方法进行对比实验,采用两种方法同时检测300例血液和干血斑标本。结果 165份血液标本的PCR-RDB复合型检测方法的结果和已知基因型完全一致。两种方法对比实验的检测结果也完全一致。300份临床标本中检测结果为:地贫阴性标本235例,占78.3%;地贫阳性标本65例,占21.7%,阳性标本中缺失型α地贫33例,非缺失型α地贫2例,β地贫25例,α地贫复合β地贫标本5例。结论基于PCR-RDB的地贫基因复合型检测方法可以准确、稳定性地进行地贫缺失型突变和点突变的检测,具有实验操作更加简捷和方便等优点,并提高了检测通量,在临床和地贫防控工作中将得到广泛的推广应用。

941对育龄高危夫妇地中海贫血基因结果分析

目的了解育龄高危夫妇地中海贫血（简称“地贫”）基因携带率、基因突变类型及分布情况。方法应用反向斑点杂交技术对941对育龄高危夫妇进行α、β地贫基因检测。结果941对高危夫妇中，检出一方或双方地贫基因发生突变790对，占83．95％；一方为α地贫、一方正常420对，占44．63％；一方为β地贫、一方正常198对，占21．04％；一方α地贫复合β地贫、一方正常33对，占3．51％；双方都异常的139对，占14．77％。双方均正常151对，占16．05％。行地贫基因检测的101例胎儿中，HbBarts水肿胎（-^SEA／-^SEA）11例、HbH病（-α^3.7^-SEA、-α^4.2／-^SEA）12例，重型β-地贫6例。结论α地贫以-^SEA／αα最为常见，β地贫以CD41—42和IVS-Ⅱ-654突变较为常见。孕前地贫基因筛查，可以降低重型地贫患儿的出生率。

重庆市开州区地中海贫血基因表达分析

目的地中海贫血是遗传性溶血性贫血的一组疾病,目前全世界还没有治疗的有效方法,所以阻断地中海贫血患儿的出生尤为重要。本研究分析重庆市开州区地中海贫血的基因类型,为该地区地中海贫血的遗传咨询和产前检查提供指导。方法 2015-10-01-2017-10-01选取重庆市开州区2家医院送检标本1 368例进行基因检测。以红细胞平均体积<80fL和(或)红细胞平均血红蛋白<27pg为入选标准,对阳性标本进行地中海贫血基因检测。结果重庆市开州区地中海贫血阳性检出率为8.18%(112/1 368)。α-地中海贫血表型者62例;β-地中海贫血表型者47例,其中38例检出基因突变;α合并β-地中海贫血3例。62例α-地中海贫血基因检出9种基因亚型,最常见的依次为--SEA/αα型(46.77%),-α4.2/αα型(17.74%),-α3.7/αα型(11.29%);38例β-地中海贫血基因检出8种基因突变类型,最常见的依次为CD17(A→T)(31.58%),CD41-42(-CTTT)(28.94%),IVS-Int-654(C→T)(18.42%)。结论重庆市开州区地中海贫血阳性检出率较高,与我国地中海贫血常见基因类型基本相同。