基于PCR的反向线杂交技术检测外阴上皮内瘤样病变中的HPV DNA

目的了解人乳头瘤病毒(HPV)在外阴上皮内瘤样病变中的感染状况和病毒型别。方法在PCR基础上用反向线杂交和测序法检测40例外阴上皮内瘤样病变患者的67处病灶。应用GP5/GP6引物,PCR扩增HPV的L1区长度为150bp的DNA片段,如结果为阴性,则采用SPF1/SPF2引物扩增同区域长度为65bp的短片段。结果采用通用引物GP5/GP6,病灶HPV DNA阳性率为52.2%(35/67);阴性的32处病灶用SPF引物扩增短片段的阳性率为81.2%(26/32),总阳性率为91.0%(61/67)。检出的HPV90%为高危类型。35例GP引物PCR扩增产物作了基因测序,其中31例单一感染病灶的测序结果与反向线杂交的结果一致,4例多重感染病灶的基因测序结果分析不成功。用SPF引物PCR扩增的26例产物中,24例成功进行基因测序,2例测序结果不能分析。结论高危型HPV与外阴上皮内瘤样病变相关,可能在浸润性外阴癌的发生中起重要作用。

7种细菌性虫媒病病原体的反向线状印迹杂交检测技术的建立

【目的】建立快速高效的细菌性虫媒病的检测方法。【方法】运用反向线状印迹杂交技术(reverse line blot,RLB),通过对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)7种细菌的核糖体16S RNA进行序列比对,利用DNAStar和Primer premier软件设计出了用于PCR-RLB杂交反应的基因组DNA样品进行PCR扩增的通用引物(RLB-F,RLB-R),和特异性探针以及通用探针(Catch-all),通用下游引物(RLB-R)5'端用生物素标记和探针5'端连接氨基团(NH_(2)^(+))。【结果】成功建立高效、快速、特异且能同时检测7种细菌PCR-RLB的方法,并确定了通用引物最佳浓度为25μmol/L,金黄色葡萄球菌和福氏志贺菌探针的最佳浓度分别为50μmol/L,其他5种病原探针的最佳浓度为100μmol/L。使用PCR-RLB检测方法,可对上述7种细菌的检测敏感性可达到10^(-6)~10^(-11) ng/μL,远远高于PCR的10^(-3)~10^(-8) ng/μL。【结论】首次同时对7种细菌进行检测,并确定了不同引物及探针的最佳浓度。该方法不仅提高了检测效率,同时还提高了检测的灵敏度,为开发新的检测手段提供了理论依据。

多重PCR/反向线点杂交(RLB)检测细菌性脑膜炎病原体的研究

目的建立快速、高通量的多重PCR/反向线点杂交(RLB)的方法检测3种细菌性脑膜炎病原体--肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌。方法针对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌的特异性基因序列设计引物和相应的特异性探针,优化多重PCR/RLB检测中的引物浓度、dNTP浓度、探针的浓度等的条件。结果多重PCR/RLB检测对肺炎链球菌DNA最低检测极限可达6.2×10-1ng/μl,对流感嗜血杆菌DNA最低检测极限可达8.5×10-8ng/μl,对脑膜炎奈瑟菌DNA最低检测极限可达8.3×10-8ng/μl。结论多重PCR/RLB检测体系能够正确的鉴定3种细菌性脑膜炎病原体,用于临床样本的高通量筛查细菌性脑膜炎病原体,特异性好,灵敏度高。

反向线点杂交方法检测和鉴定4种常见致病支原体

目的评价反向线点杂交方法检测生殖支原体、人型支原体、微小脲原体和解脲脲原体的敏感性。方法应用支原体反向线点杂交方法和种特异性PCR方法同时检测198例临床标本,比较两种方法的检测结果。结果支原体反向线点杂交方法和种特异性PCR检测支原体阳性率分别为33.3%和34.3%,两种方法检测结果符合率为98.5%。3例标本支原体种特异性PCR方法检测微小脲原体阳性,而反向线点杂交方法检测为阴性。两种方法检测支原体结果无显著性差异(P>0.05)。结论反向线点杂交方法能同时快速、敏感和特异的检测这4种支原体。

应用反向线点杂交技术鉴定临床常见曲霉属和毛霉目真菌

目的应用反向线点杂交技术(reverse line blot hybridization,RLB)快速鉴定临床常见的曲霉属和毛霉目真菌。方法收集我院真菌和真菌病研究中心保存的5种曲霉菌(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉)和7种毛霉目真菌(冻土毛霉菌、总状毛霉菌、卷枝毛霉菌、少根根霉、小孢根霉、微小根毛霉、伞状犁头霉),共计98株菌株。利用真菌通用引物ITS1和ITS4对菌株进行PCR扩增,用12个真菌种特异性探针与扩增后产物进行反向线点杂交。将RLB结果与真菌传统形态学鉴定结果、ITS区DNA测序结果进行比较。结果 RLB可以正确鉴定98株实验菌株,与形态学方法和ITS区测序方法鉴定结果100%一致,种特异性探针之间未见交叉杂交,显示出该方法的高度敏感性和特异性。8株阴性对照菌株(白念珠菌、茄病镰刀菌、尖端赛多孢、马尔尼菲青霉、疣状瓶霉、棒曲霉、日本曲霉以及雅致小克银汉霉),使用RLB方法无法鉴定。通过烟曲霉基因组DNA浓度10倍倍比稀释法验证RLB的敏感性为1.8×10-3 ng/μL。结论 RLB技术为实验室早期快速诊断、鉴定临床常见的曲霉属和毛霉目真菌提供参考。

反向线点杂交技术检测宫颈腺癌组织中人乳头状瘤病毒分型

目的检测人乳头状瘤病毒(HPV)在宫颈腺癌组织中的感染程度和病毒分型。方法采用PCR反向线点杂交和测序方法检测67例宫颈腺癌组织中HPV分型。结果宫颈腺癌和腺鳞癌组织中HPV-DNA的总阳性率为86.9%;HPV16、HPV18和HPV31是较常见高危型,构成比分别占32.3%、16.1%和16.1%,各类型HPV构成比差异无统计学意义;HPV阳性宫颈腺癌中,单一类型HPV感染占77.4%,多重HPV感染占22.6%,差异有统计学意义(χ2=18.645,P<0.01)。结论高危型HPV感染与宫颈腺癌发生相关,单一类型HPV感染较多重感染常见;虽然HPV16和HPV18型占大多数,但未发现某一型别HPV在宫颈腺癌组织中占主导地位。

PCR／反向线点杂交鉴定临床分离念珠菌

研究证实，真菌转录间隔区（internal transcriptional spacer，IＴs）和5．8SrRNA区域中的碱基序列在不同种属间具有较高的特异性，而在种属内则相对保守［1-3］。迄今，“ITSl＋5．8SrRNA＋ITS2”测序法已被公认为真菌种属鉴定的参考方法［1.4］。

性病门诊人群泌尿生殖道沙眼衣原体混合感染及分型研究

目的了解性病门诊人群泌尿生殖道沙眼衣原体混合感染及基因型分布特点。方法对2048例性病门诊就诊者分别取尿道或宫颈拭子,实时聚合酶链反应(PCR)检测沙眼衣原体(CT)感染,阳性标本用套式PCR扩增ompl VD2区片断,反向线点杂交(RLB)检测特异性型别。结果CT总体感染率为15.9%(325/2048)。对287份阳性标本成功分型,型别分布为:F21.6%,E20.9%,J19.9%,D12.9%,G8.4%,K4.2%和H1.4%,31份(10.8%)为混合感染。结论在性病门诊人群中CT感染率较高,主要流行型别为F、E和J型,且具有较高的混合感染率。

基于分子生物学技术的吸血节肢动物血餐宿主鉴定方法研究概述

吸血节肢动物作为虫媒传染病的重要传播媒介,其宿主的确定对理解虫媒传染病生态学及采取进一步的防控措施具有重要意义。血餐鉴定策略是识别节肢动物宿主的有效方法,随着分子生物学技术的发展,DNA检测方法提高了吸血节肢动物血餐鉴定的特异性和敏感性,常用的分子生物学方法有PCR、DNA序列测定、异源双链分析、限制性片段长度多态性分析、反向线点杂交技术和DNA指纹图谱等。通过对分子生物学技术在节肢动物血餐宿主研究中的原理及优缺点进行综述,以期为相关虫媒疾病防控提供参考。