利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组SA11轮状病毒

目的利用反向遗传技术产生NSP1基因插入和表达外源基因的重组SA11轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体。方法本研究将轮状病毒SA11株的NSP1基因片段的223位(5端)至1388位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止-再启动元件(P2A)的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因,采用已建立的“12质粒”轮状病毒反向遗传系统拯救NSP1基因插入和表达EGFP的重组SA11轮状病毒。通过观察细胞病变效应和插入基因(EGFP)的荧光表达初步确定重组病毒的成功拯救,再结合电镜的形态学观察、RT-PCR的测序结果及病毒基因组的检测结果,进一步证明重组轮状病毒的成功拯救和传代扩增。利用TCID 50法和qRT-PCR法,测定了rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的病毒滴度并绘制了基因组复制动力曲线。结果基于“12质粒系统”成功拯救了重组轮状病毒rSA11/NSP1-EGFP,证明NSP1片段截短并插入外源基因后病毒仍可正常复制,且具有良好的遗传稳定性,但病毒滴度低于其亲本株。结论基于NSP1基因插入和表达EGFP的重组轮状病毒能够实现稳定遗传,为利用反向遗传学构建表达外源基因的轮状病毒载体的深入探索提供了基础。

表达增强型绿色荧光蛋白的C型禽偏肺病毒反向遗传系统的构建及优化

【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入C型aMPV(aMPV/C)基因组中,构建表达EGFP的重组aMPV,并使用不同的载体及启动子构建aMPV迷你基因组,来优化aMPV反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS)的构建。【方法】将EGFP插入pBluescript-aMPV RGS的P和M蛋白之间非编码区并进行拯救,观察绿色荧光蛋白的表达情况,同时测定重组病毒滴度及遗传稳定性。为优化RGS的构建,采用含有T7启动子的pBluescript SK(+)和含有T7、CMV启动子的pcDNA3.1两种载体构建aMPV迷你基因组。首先将aMPV/C基因组两端的先导区(leader)和尾随区(trailer)与EGFP的cDNA进行PCR扩增,并切胶回收;其次将各胶回收片段按照leader-EGFP-trailer的顺序进行无缝克隆连接,并测序验证;最后将连接完整的迷你基因组反向插入两个载体中,构建aMPV/C的迷你基因组(pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C)。在拯救迷你基因组的试验中,将两个aMPV/C迷你基因组与3个表达N、P和L蛋白的质粒共转染到BHK-21细胞中,观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】拯救的aMPV-EGFP重组病毒测序结果显示,EGFP已成功插入aMPV基因组中,并在前3代aMPV-EGFP重组病毒中稳定表达。aMPV-EGFP重组病毒滴度在感染96 h后达到105.5 TCID 50/mL。而pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个重组质粒的测序结果也证明了含有EGFP的aMPV迷你基因组构建完成。将3个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,转染24 h后观察到细胞中绿色荧光蛋白表达,证明aMPV-EGFP重组病毒及pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个aMPV迷你基因均都成功表达了EGFP。【结论】本研究成功构建了两个aMPV迷你基因组并拯救了aMPV-EGFP重组病毒,重组病毒具有良好的遗传稳定性。而CMV和T7作为aMPV/C RGS中的启动子时,二者的拯救效率相同。pBluescript SK(+)和pcDNA3.1均可用于aMPV/C RGS的构建,本研究为aMPV/C RGS的构建提供了多种方法。

猫杯状病毒反向遗传系统的建立及弱毒株的构建

为了构建猫杯状病毒(FCV)弱毒疫苗候选株,从杭州流行的FCV毒株FCV-HZ-DF-19中提取基因组RNA,利用RT-PCR技术分3段扩增获得FCV全基因组,通过同源重组的方法将全长基因组克隆至已插入榔头状核酶(HamRz)和丁型肝炎核酶(HdvRz)的PCI载体,获得中间质粒pPCI-FCV;以pPCI-FCV为模板扩增获得含HamRz、HdvRz和FCV全基因组的产物FCV-H,并将其连接到BAC载体中获得含有FCV全基因组的克隆pBAC-FCV。将pBAC-FCV转染猫肾细胞F81连续传代后收获病毒。针对FCV毒力相关的LC基因进行缺失,获得感染性克隆pBAC-FCV-ΔLC,通过转染表达FCV-VP1蛋白的猫肾细胞系进行病毒拯救。结果显示,拯救毒株rBAC-FCV和LC基因缺失毒株rBAC-FCV-ΔLC均可产生细胞病变;测序结果表明,拯救毒株的基因序列与亲本毒株FCV-HZ-DF-19一致,且生长曲线与亲本毒相似,而基因缺失毒株的生长则慢于亲本毒株,产生的噬斑大小也明显小于亲本毒株,表明缺失LC基因后病毒毒力下降。结论:本研究成功构建了FCV的反向遗传系统及基因缺失弱毒株,为后续弱毒疫苗研发和FCV生物学特性研究奠定了基础。

瘟病毒反向遗传技术的研究进展及应用

瘟病毒属于黄病毒科(Flaviviridae),核酸为单股正链RNA,基因组长12.3 kb。反向遗传技术是研究病毒蛋白功能的有力工具,已经成为研究瘟病毒属的有效途径。介绍了瘟病毒的基本特征,概述了瘟病毒反向遗传操作技术的建立和发展过程,综述了牛病毒腹泻病毒(BVDV)、猪瘟病毒(CSFV)及其他瘟病毒反向遗传操作系统的构建以及应用该技术取得的一些研究成果,并对该技术在瘟病毒研究领域的发展方向进行了展望,以期为瘟病毒属编码的蛋白质的功能、致病机制以及新型疫苗研发开辟新思路。

传染性支气管炎病毒反向遗传系统的构建策略与应用

传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)是一种具有高度传染性的禽冠状病毒,主要感染鸡的呼吸系统、肾脏和生殖系统等,是导致家禽产业经济损失的主要原因之一。IBV血清型和基因型众多,不同毒株之间交叉保护性差,疾病防控困难。IBV反向遗传系统的建立与应用为病毒分子水平研究、致病机制研究和新型疫苗研发等提供了新的途径。本文主要介绍了IBV反向遗传技术的构建策略,包括细菌人工染色体(载体)系统、体外连接系统、痘病毒载体系统和基于靶向RNA重组技术等,以及IBV反向遗传系统在病毒基因组结构和功能研究、新型疫苗研发和病毒表达载体研究等方面的应用,以期能为IBV的研究提供参考。

鸡传染性支气管炎病毒反向遗传技术研究进展

鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)感染引起的鸡的一种急性、高度接触性传染性病。IBV基因组非常容易发生突变和重组,给该病防控带来巨大困难,因此高效疫苗和有效药物的研发非常重要。反向遗传技术是研究RNA病毒的重要技术。通过反向遗传技术可以在DNA分子水平定向改造病毒序列,对病毒的基因功能、致病机制以及新型疫苗进行研究。论文对构建IBV操作系统的策略、利用反向遗传技术研究IBV基因结构和功能、研发新型疫苗以及开发病毒载体的最新进展进行综述,为IBV及其他冠状病毒相关研究提供参考。

新城疫病毒Mukteswar株反向遗传平台的建立

为了建立新城疫疫苗株Mukteswar株的反向遗传操作系统,根据Mukteswar株的基因序列设计了9对引物,扩增获得基因组片段,通过Overlap PCR和In-Fusion无缝克隆的技术,将9个片段拼接和插入至pACNR-T7中,获得了Mukteswar株全长cDNA克隆质粒pAC-Mukteswar。将其和3个辅助质粒(pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L)共转染至预先感染了痘病毒vTF7-3的BHK-21细胞,成功拯救出重组病毒rMukteswar。对rMukteswar的生长曲线、最小致死剂量的平均致死时间(MDT)等生物学特性进行测定,结果显示rMukteswar具有和野生株相似的增殖特性和毒力。成功建立了新城疫疫苗株Mukteswar的反向遗传操作系统,为研发高效率表达外源病原体蛋白的新城疫载体疫苗奠定了基础。

塞内卡病毒A反向遗传技术及其应用

塞内卡病毒A(SVA)是引起猪口鼻部、蹄冠部水疱样病变,甚至引起新生仔猪急性死亡的新发病毒。SVA是无囊膜的单股、正链RNA病毒,由于其基因组不断发生重组和进化,因此给养猪业造成较大的经济损失。反向遗传作为一种从基因入手开展体外遗传学研究的技术,能够在病毒cDNA分子水平上进行基因定向改造,进而借助宿主细胞实现病毒复制、翻译、包装和拯救的目的,最终研究重组病毒的生物学特性。本文就SVA反向遗传技术的研究及其应用进行综合评述,以期为进一步探究SVA复制、表达、调控等分子机制提供思路。

正呼肠孤病毒反向遗传系统及病毒载体研究进展

正呼肠孤病毒(orthoreovirus)是一种分节段的双链RNA病毒,其宿主范围广泛,对人和动物健康构成了严重威胁。由于正呼肠孤病毒结构复杂,反向遗传系统构建困难,导致其相关研究滞后于其他RNA病毒。自2007年一种完全基于质粒的正呼肠孤病毒反向遗传系统被报道以来,关于正呼肠孤病毒基因和蛋白功能的研究不断增多。本文以哺乳动物正呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV)和禽正呼肠孤病毒(avian orthoreovirus,ARV)为例,概述了正呼肠孤病毒反向遗传系统和病毒载体研究的最新进展,并对未来发展趋势进行展望,以期为正呼肠孤病毒载体疫苗研发提供参考。

3种常发冠状病毒的反向遗传技术及应用进展

冠状病毒是一类引起动物和人类疾病的有包膜RNA病毒,可导致人和动物发病,危害严重,如严重急性呼吸综合征病毒、中东呼吸综合征病毒、新型冠状病毒等,尤其是2019年末暴发的新型冠状病毒更是呈现全球大流行,严重危害了人健康和阻滞了全球经济发展。而鸡传染性支气管炎病毒和猪流行性腹泻病毒则是2种常见的严重危害家禽和生猪养殖的病原。本文简述了新型冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒和猪流行性腹泻病毒3种冠状病毒的流行趋势,着重介绍了反向遗传学技术在这3种病毒研究中的应用现状,以期能为冠状病毒等单股正链RNA病毒的研究提供一定参考的意义。

甲型流感病毒反向遗传操作系统研究进展

甲型流感病毒(IAV)是一类严重危害人畜健康的人兽共患病病毒。经过三十多年的发展,从基因型到表型的反向遗传操作系统已被熟练应用于IAV各方面的研究。反向遗传操作系统彻底改变了传统的IAV研究策略,能够通过在基因组中引入特定的突变而改变病毒生物学特性,也为疫苗的研制提供了新思路。本文就IAV反向遗传操作系统的发展历史和基本原理进行了综述。

反向遗传操作技术产生全禽源致弱的H5N1亚型禽流感病毒的免疫保护性试验

利用反向遗传操作技术产生致弱的8基因全禽源的H5N1亚型禽流感病毒rgF-H5△N1,经甲醛灭活制成油苗免疫SPF鸡和有母源抗体的商品鸡。比较拯救的重配病毒rgF-H5△N1和野毒H5N1亚型禽流感病毒油苗免疫后的抗体应答水平、攻毒后发病率和死亡率等指标,评价其免疫和交叉免疫保护作用。结果表明:反向遗传操作技术为构建新型的流感疫苗株提供了更好的方法。

反向遗传学技术及其在FMDV研究中的应用

反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术 ,已广泛应用于生命科学研究的各个领域。综述反向遗传技术研究进展 ,并讨论该技术在口蹄疫病毒研究中的应用。

RNA病毒的反向遗传学

反向遗传操作作为一种新兴技术在RNA病毒的研究中发挥着重要作用 ,本文介绍了RNA病毒反向遗传学的研究方法以及RNA病毒反向遗传技术的最新研究进展。

反向遗传学技术应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒研究的进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinere productive and respiratory syndrome virus, PRRSV)属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员。根据血清学和遗传特性的差异,可将PRRSV分为欧洲型(1型)和美洲型(2型)[1]。随着反向遗传操作系统的建立,使对RNA病毒基因组在其cDNA分子水平上进行体外人工操作成为可能,如对基因进行点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造。近年来,科学家通过对PRRSV基因组的反向遗传操作[2-6],在研究PRRSV的基因复制、亚基因组转录与表达调控机理、PRRSV与宿主间的相互作用关系以及PRRSV用于异源基因表达载体来开发抗病毒疫苗等研究,取得了一些显著成果。本文就应用反向遗传学技术来研究PRRSV的进展报告做一综述。

新城疫病毒反向遗传技术研究进展

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）引起禽类的一种急性、高度接触性传染病，也是目前严重危害我国养禽业的主要疫病之一。虽然NDV只有一个血清型，但不同毒株之间的毒力存在明显差异。有关NDV毒力及其相关决定因素的研究一直是世界范围内的研究热点，其中反向遗传学操作技术是进行NDV毒力相关基因研究的一种主要技术手段。

反向遗传学技术及其在狂犬病病毒研究中的应用

反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术,已广泛应用于生命科学研究的各个领域。本文综述反向遗传学技术研究进展,并讨论该技术在狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)研究中的应用。

利用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感高产疫苗株

采用RT-PCR技术分别扩增了鹅源高产禽流感病毒的6条内部基因片段，近期分离的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因以及N3亚型参考毒株的神经氨酸酶基因，分别构建了8个基因的转录与表达载体，利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽源的重组流感病毒疫苗株rH5N3。通过对血凝素蛋白HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸（R-R-R-K-K）基因缺失与修饰，从而消除了病毒基因的毒力相关序列，拯救的rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性，病毒在鸡胚尿囊液和细胞培养上清的HA效价得到极大提高，分别为1：2048和1：512。制备的禽流感疫苗免疫动物后4～5周即可诱导产生高效价的HI抗体，鸡免疫后18周依然保持高水平的HI抗体。重组疫苗不论是对于国内早期分离的禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96还是近期分离的A／Goose／HLJ／QFY／04都能够产生完全的免疫保护作用，免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。带有N3鉴别诊断标记禽流感疫苗株的研制为H5N1高致病性禽流感的防治提供了新的技术保障。

一株类禽型H1N1亚型猪流感病毒的反向遗传系统的建立

为建立H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(JS40)的反向遗传系统,本研究分别构建了JS40株8个基因节段的重组质粒,经转染293T和MDCK混合细胞,拯救出病毒R-JS40。序列测定结果表明,救获病毒与亲本病毒的核苷酸序列一致,无氨基酸变异,可以稳定传代;抗原性未发生变化;对小鼠的致病性结果显示R-JS40与JS40对小鼠的组织嗜性以及在肺脏中复制的病毒滴度基本一致。以上结果表明R-JS40保持了亲本病毒JS40的生物学特性,该病毒反向遗传操作系统的建立,为进一步开展病毒的致病分子基础以及新型疫苗的研制提供有效的技术平台。