反向遗传学技术及其在狂犬病病毒研究中的应用

反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术,已广泛应用于生命科学研究的各个领域。本文综述反向遗传学技术研究进展,并讨论该技术在狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)研究中的应用。

应用反向遗传学技术在哺乳动物细胞中产生甲型流感病毒

在国内首次应用反向遗传学技术将多个质粒共转染哺乳动物细胞 ,得到了具有活性的甲型流感病毒。采用自行构建的含有 polⅠ和polⅡ启动子和终止子序列的pIVV2质粒 ,将A/PR/8/34(H1N1)流感病毒基因组全部 8个RNA节段的cDNA分别克隆到该质粒的两个启动子之间 ,得到了 8个可在真核细胞中复制和表达的质粒。将这 8个质粒共转染 2 93T细胞 ,培养 4 8h后吸取上清液 ,转接入MDCK细胞中 ,再经过 72h培养 ,发现在MDCK细胞中有明显的流感样细胞病变产生 ,测上清病毒血凝滴度为 1:10。将MDCK细胞冻融液继续接种鸡胚和MDCK细胞 ,培养后将鸡胚尿囊液和MDCK细胞冻融上清液进行血凝和血凝抑制实验 ,证明所得病毒为A/PR/8/34(H1N1)。

利用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感高产疫苗株

采用RT-PCR技术分别扩增了鹅源高产禽流感病毒的6条内部基因片段，近期分离的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因以及N3亚型参考毒株的神经氨酸酶基因，分别构建了8个基因的转录与表达载体，利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽源的重组流感病毒疫苗株rH5N3。通过对血凝素蛋白HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸（R-R-R-K-K）基因缺失与修饰，从而消除了病毒基因的毒力相关序列，拯救的rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性，病毒在鸡胚尿囊液和细胞培养上清的HA效价得到极大提高，分别为1：2048和1：512。制备的禽流感疫苗免疫动物后4～5周即可诱导产生高效价的HI抗体，鸡免疫后18周依然保持高水平的HI抗体。重组疫苗不论是对于国内早期分离的禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96还是近期分离的A／Goose／HLJ／QFY／04都能够产生完全的免疫保护作用，免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。带有N3鉴别诊断标记禽流感疫苗株的研制为H5N1高致病性禽流感的防治提供了新的技术保障。

口蹄疫病毒反向遗传学研究进展

反向遗传学操作技术在口蹄疫病毒(FMDV)病原学基础研究领域的应用,使得人们能够在基因组整体水平上研究病毒基因的功能。得益于反向遗传学系统的不断完善和发展,目前人们对FMDV分子病原学也有了更加深入的认识和理解。本文结合实验室在FMDV反向遗传学方向上所开展的探索性研究工作,综述了国内外利用反向遗传学操作技术在研究FMDV分子致病机制、病毒毒力与变异的关系、病毒复制的影响因素、新型FMD基因疫苗的研制等领域所取得的进展,展望FMDV反向遗传学研究新动向。

采用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感疫苗株

目的构建重组H5亚型禽流感疫苗株。方法采用RT-PCR技术,分别扩增鹅源高产禽流感病毒A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)的6条内部基因片段、高致病性禽流感病毒株A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)的血凝素(HA)基因和N3亚型参考株A/Duck/Germany/1215/73(H2N3)的神经氨酸酶(NA)基因,并对HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸(R-R-R-K-K)的编码序列进行缺失与修饰,然后分别构建这8个基因的转录与表达载体,将其共转染293T/MDCK混合培养细胞单层,对拯救出的重组病毒进行表型分析。结果利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽流感病毒的疫苗株,其基因序列符合设计要求包括删除HA基因的毒力相关序列,疫苗株的表型为H5N3。结论构建成功重组禽流感疫苗株rH5N3,为制备H5亚型禽流感疫苗打下了坚实的基础。

反向遗传学技术及其在FMDV研究中的应用

反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术 ,已广泛应用于生命科学研究的各个领域。综述反向遗传技术研究进展 ,并讨论该技术在口蹄疫病毒研究中的应用。

反向遗传学在现代生物学领域中的应用

反向遗传学是一种新兴的分子生物学技术。主要从反向遗传学的含义、研究方法及应用等角度进行综述,并介绍有关反向遗传学研究的最新进展。

RNA病毒的反向遗传学

反向遗传操作作为一种新兴技术在RNA病毒的研究中发挥着重要作用 ,本文介绍了RNA病毒反向遗传学的研究方法以及RNA病毒反向遗传技术的最新研究进展。

戊型肝炎的研究进展及反向遗传学在戊肝研究中的应用

综述了戊型肝炎的研究进展以及反向遗传学技术在戊肝研究中的应用,讨论了戊肝研究的公共卫生学意义。

反向遗传学技术及在RNA病毒研究中的应用

RNA病毒的反向遗传学技术是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术,该技术通过人为加入DNA基因片段,实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组的人工操作。反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作,为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。自20世纪70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆构建成功以来,RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,这在很大程度上归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立。文章介绍了反向遗传学技术的基本特点、技术方法及其在正、负链RNA病毒的基因功能、致病机制及新型病毒载体等方面的研究及应用情况。

动物RNA病毒反向遗传学操作技术及应用进展

本文简述了反向遗传操作技术的基本原理以及近年来动物RNA病毒基因复制与表达调控机理、病毒与宿主间的相互作用,以及构建新型病毒载体和研发新型疫苗等方面的研究进展。

反向遗传学技术应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒研究的进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinere productive and respiratory syndrome virus, PRRSV)属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员。根据血清学和遗传特性的差异,可将PRRSV分为欧洲型(1型)和美洲型(2型)[1]。随着反向遗传操作系统的建立,使对RNA病毒基因组在其cDNA分子水平上进行体外人工操作成为可能,如对基因进行点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造。近年来,科学家通过对PRRSV基因组的反向遗传操作[2-6],在研究PRRSV的基因复制、亚基因组转录与表达调控机理、PRRSV与宿主间的相互作用关系以及PRRSV用于异源基因表达载体来开发抗病毒疫苗等研究,取得了一些显著成果。本文就应用反向遗传学技术来研究PRRSV的进展报告做一综述。

猪繁殖与呼吸综合征病毒强、弱毒株Nsp9基因的反向遗传学替换改造

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9基因编码RNA依赖的RNA聚合酶,在病毒复制中发挥重要作用。为了探索Nsp9基因与病毒的毒力、复制能力及细胞嗜性的相关性,本研究利用反向遗传学技术将PRRSV弱毒疫苗毒CH-1R的Nsp9基因进行克隆,酶切后连接到强毒株XH-GD的感染性克隆上,进行病毒的拯救。结果表明,成功构建替换了CH-1RNsp9基因的重组病毒。对重组病毒的生物学特性研究发现,拯救病毒的生长速度和病毒滴度明显高于亲本毒株rXH-GD,但是低于疫苗毒CH-1R,重组毒株的噬斑大小与CH-1R相似,初步推测疫苗株CH-1R的聚合酶有助于提高病毒的滴度。本试验为进一步研究Nsp9基因对病毒毒力的影响奠定基础。

反向遗传学在猪繁殖与呼吸综合征病毒研究中的应用

反向遗传学遵循“中心法则”,在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体[1].猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为单股正链RNA病毒,基因组约为15 kb,有8个开放阅读框架（ORF）,ORF1位于基因组的5’末端,编码病毒非结构蛋白,ORF2～7位于基因组的3’末端,编码病毒结构蛋白,PRRSV能引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疫病.

反向遗传学技术及其应用

反向遗传学是直接从遗传物质入手来研究生命现象与规律的,其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景。文章从拯救病毒和创造新型病毒、负股RNA病毒的研究、动植物基因功能的研究以及利用RNA干扰使基因沉默等方面,对反向遗传学技术的应用进行了评述,并对其前景进行了阐述。

反向遗传学技术的应用

反向遗传学是直接从遗传物质入手研究生命现象与规律,其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景。作者对反向遗传学技术的应用进行了评述。