基于同源重组和反向PCR扩增技术构建BRD7溴区结构域缺失突变体

目的:利用同源重组和反向PCR扩增技术构建溴区包含蛋白7(bromodomain-containing protein 7,BRD7)的溴区结构域(bromodomain)缺失的真核表达载体。方法:设计一对反向PCR引物,以预先构建好的p IRES2-EGFP-3Flag/BRD7质粒为模板,利用高保真酶的高保真性和较长的延伸能力,反向扩增出BRD7溴区结构域缺失突变体(p IRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd)的线性DNA片段,然后转化大肠杆菌,利用大肠杆菌同源重组修复能力即可自身环化,而不需要经连接酶连接或其他处理即可得到p IRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd重组表达质粒,通过测序和Western印迹进一步对该缺失突变体的序列和蛋白质表达性能进行验证。结果:通过酶切鉴定、测序和Western印迹证实p IRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd构建成功。结论:利用PCR反向扩增和同源重组技术,可以简便快速地构建p IRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd突变体,实验成本较低,并且发现质粒模板浓度会影响载体的同源重组效率,这种改进的技术可广泛应用到基因突变体的构建。

全长cDNA克隆的三种方法的比较研究

为了得到一段EST所在基因的全长 ,采用了快速扩增cDNA末端 (RACE)、cDNA文库构建、λphage测序引物与特异性引物结合、非放射性探针进行噬菌体原位杂交等方法分别对该基因进行了克隆 ,结果得到了一致的全长cDNA ,三种不同实验方法的应用 ,为更方便。

韶关地区7980例女性HPV感染与基因分型

目的研究韶关地区女性人乳头瘤病毒(HPV)感染情况及基因亚型分布,为粤北地区宫颈癌初期的诊断和治疗提供科学数据。方法采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的技术,对7 980例患者的宫颈脱落细胞进行HPV-DNA基因分型检测,并对其感染率、亚型分布及其与年龄的相关性进行统计学分析。结果 7 980例标本中检测出HPV阳性标本2 402例,总阳性率为30.1%,其中感染前5位亚型分别为16、52、51、58、6;2 402例HPV阳性标本中共检出3 224株HPV病毒,其中低危型716例,占22.21%,以6、81亚型为主;高危型2 508例,占77.79%,以16、52、51、58亚型为主;单一亚型感染构成比为74.11%(1 780/2 402),多重感染构成比为25.89%(622/2 402),且以二重感染、三重感染为主;不同年龄段HPV感染率不同,30~50岁是HPV感染的高峰年龄段,HPV阳性检出率在各年龄组的差异有统计学意义(P<0.05)。结论韶关地区女性HPV感染率较高,其亚型分布特点及感染年龄段有明显地区性,为本地制订HPV防治制度提供参考依据。