反复贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞

目的:原代培养鼠主动脉平滑肌细胞,传统贴块法往往由于血管片成功贴壁数少而导致失败或存在培养周期长的缺点。反复血管片贴壁法能够克服以上弊端,本实验拟进一步验证。方法:实验于2007-03/06在南昌大学第二附属医院江西省分子中心重点实验室完成。①实验方法:健康Wistar大鼠2只,断颈法处死,分离胸主动脉,清除结缔组织,纵向剖开血管去除内皮细胞,继续用力刮可见血管片分为两层,去掉外层,剩下即为所需的中膜组织,剪细置于无菌培养瓶底,组织块间距不超过0.5cm,瓶底朝上,向培养瓶内加入5.0～6.0mL含体积分数为0.15胎牛血清的培养液后,放在大平皿上使瓶口稍朝上,置于37℃孵箱,一次性培养瓶放置1h(普通培养瓶2～3h)后将其缓慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中。当一些组织块周围细胞生长相当密集以致失去特有的梭形形态时,即可按1∶1或1∶2进行传代。②实验评估:采用相差显微镜观察细胞的生长形态及生长规律。免疫化学法检测α-平滑肌肌动蛋白的表达。结果:①细胞生长形态:原代培养第3天,贴附良好的血管片周围细胞呈辐射状生长,形态多样。4～10d细胞数量增多,细胞生长至融汇后相互平行排列成束或放射状,血管平滑肌细胞特征性"峰"、"谷"状生长特点尤为明显。细胞生长相当密集而传代。②α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学检测:胞浆内出现肌丝,纵向平行排列有密区,α-平滑肌肌动蛋白免疫化学染色呈阳性(棕色)。结论:利用反复血管片贴壁法成功进行大鼠主动脉平滑肌细胞的原代培养,具有简便易行、细胞损失小、培养周期短等优点。