Tet-on基因表达系统反应质粒P^(TRE-HIF-1α)的构建和表达鉴定

目的克隆和构建携带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α。方法以缺氧的肝癌细胞株HepG2总RNA为模板,进行RT-巢式PCR,获得HIF-1α的cDNA,克隆入Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE2hyg,酶切重组子鉴定。将构建好的PTRE-HIF-1α用脂质体法转入HepG2Tet-on细胞,在强力霉素的作用下,用RT-PCR及Westernblot法鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1α的cDNA测序结果与Genbank记载完全一致,并成功克隆入PTRE2hyg,将反应质粒PTRE-HIF-1α转入HepG2Tet-on细胞,可以完整有效表达HIF-1α且受强力霉素的调控。结论成功克隆和构建携带HIF-1α基因的Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α,并证明其表达能在HepG2Tet-on细胞中受强力霉素调控。

大鼠PTHrP亚基因的克隆及其真核反应质粒的构建

目的:克隆甲状旁腺相关肽(PTHrP)亚基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)并构建四环素反应性元件调控的反应质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139),为调控PTHrP亚克隆在软骨前体细胞中的表达打下基础。方法:提取骨骺干细胞的总RNA,以RT-PCR方法获得带有酶切位点的PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)基因片段,扩增的DNA片段分别与含潮霉素筛选标记的四环素反应性元件载体pTRE-2Hyg双酶切后连接,转化扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定。结果:经酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒。结论:成功克隆出PTHrP亚克隆基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)并构建了反应质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139),为进一步精确调控PTHrP亚基因的表达奠定了基础。

PTEN基因亚克隆和pTRE-PTEN反应质粒构建

目的 亚克隆野生型与张力蛋白在 10号染色体同源缺失的磷酸酶 (PTEN)基因 ,构建四环素反应性元件调控的与张力蛋白在 10号染色体同源缺失的磷酸酶反应质粒 (pTRE PTEN)。方法以pBP PTEN质粒为模板 ,应用pfuDNA聚合酶 ,多聚酶链反应法 (PCR)扩增PTENcDNA。将扩增的PTENcDNA与三磷酸脱氧腺苷 (dATP)反应 ,然后将产物与pGEM T Easy载体直接连接 ;连接产物转化大肠杆菌DH5α,蓝白筛选 ,挑选白色克隆作鉴定测序。将测序正确的pGEM T Easy/PTEN和带潮霉素筛选标记的四环素反应性元件质粒 (pTRE2Hyg)分别双酶切 ,前者回收 1.2kb的PTEN片段 ,后者回收线性化的pTRE2Hyg片段 ,将两者连接成 pTRE PTEN表达重组体 ,转化大肠杆菌DH5α ,抽提重组体质粒 ,经NotⅠ和SalⅠ酶切鉴定阳性克隆含有大小约 6 .4kb和 1.2kb的两条带。结果 成功地从 pBP PTEN质粒中亚克隆人PTENcDNA ,并构建了pTRE PTEN反应质粒。结论 pTRE PTEN反应质粒的构建为建立pTet on PTEN

质粒缺口-连接酶链反应-ELISA法检测重庆地区围生期孕妇沙眼衣原体感染及基因分型

目的:用质粒缺口-连接酶链反应(Gap-LCR)-ELISA法研究重庆地区围生期孕妇沙眼衣原体(CT)感染的现状及流行的主要基因型别,为其疫苗的研制提供分子流行病学依据。方法:以512例孕妇的首段尿(FVU)及其配对新生儿的鼻咽拭子为标本,用质粒Gap-LCR-ELISA法检测CT感染者,对阳性母、婴配对标本DNA行omp1-VS4-PCR扩增,产物行双链DNA直接测序并作基因分型。结果:所检重庆地区孕妇CT感染率为7.42%,母婴垂直传播率为15.79%,以阴道分娩为主要传播途径。6对阳性母婴配对标本的CT基因序列一致,其中5对为E型,1对为H型,再次证实了CT的垂直传播途径。结论:质粒Gap-LCR-ELISA法可用于围生期无症状CT感染孕妇的大规模流行病学调查。重庆地区围生期CT流行型别仍以E型为主。

用质粒Gap-LCR-ELISA法检测孕妇尿中沙眼衣原体

目的:研究孕妇尿液中对质粒缺口-连接酶链反应(Gap-LCR)-ELISA法检测沙眼衣原体(CT)产生抑制作用的物质及其去除方法,以提高该方法检测无症状孕妇CT感染的灵敏度。方法:对181份孕妇首段尿(FVU)进行全面尿化学分析后,采用CT标准株“Spike”法(铆钉法),对出现Gap—LCR—ELISA抑制的标本用多因素非条件Logistic回归分析与抑制作用相关的成分,在进行一系列去抑制处理后比较各方法的转阳率。结果:孕妇FVU对质粒Gap-LCR-ELISA检测CT的抑制率为6.08％(11/181),其中白细胞和磷酸盐结晶与抑制作用相关;对FVU作-70℃～37℃快速冻融2次的预处理可使90.91％的假阴性转为阳性,并对模板无明显降解作用。结论:孕妇尿液中确有对Gap—LCR—ELISA产生抑制作用的物质存在,可通过改良标本预处理的方法降低其所致的假阴性。

鼠疫菌苗EVp（Lcr^—）株小鼠被动保护实验

利用脂质体包裹去除了低钙反应质粒（Ｌｃｒ）的鼠疫菌ＥＶｐ（ＥＶｐＬｃｒ￣－）株及ＥＶ活菌苗分别免疫家兔，收集血清进行小鼠被动保护实验，以比较其杀菌作用。发现两种血清分别与攻毒菌（ＥＶ－ｐＬｃｒ￣＋）混合后，经小鼠尾静脉注射后０．５小时，小鼠血液和脾脏中均能分离到菌，从第一天开始，血液中不再有菌，脾脏菌量呈下降趋势，ＥＶ组到第四天时菌已消失，而ＥＶｐＬｃｒ－组在第七天仍能分离到菌，生理盐水组在第三天即出现小鼠死亡，到第五天全部死亡，三组间脾脏内菌量存在显著性差异，均值依次为生理盐水组＞ＥＶｐＬｃｒ－组＞ＥＶ组，（Ｐ＜０．０１）。本实验表明，去除了Ｌｃｒ质粒的鼠疫菌，其免疫血清中抗体的质与量均低于有Ｌｃｒ质粒的鼠疫菌，杀菌效果明显降低。反映了特异性抗体的缺失。从疫苗角度讲，缺失某一质粒的疫苗株在遗传学特性上稳定，发展该种活疫苗可能是今后的研究方向，对其免疫效果仍需进一步进行研究，以找到能够产生高效免疫力和保护力的菌苗株。