乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白2基因的克隆化研究

目的 :应用抑制性消减杂交 (SSH )技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前 S1蛋白 (pre S1)反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法 :以HBV前 S1蛋白表达质粒 pcDNA3 1( -) pre S1转染HepG2细胞 ,以空载体 pcDNA3 1( -)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HBV前 S1反式激活作用的新的靶基因。结果 :对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被前 S1蛋白反式激活 ,故命名为前 S1反式激活蛋白 2 (PS1TP2 ) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY42 6673。PS1TP2基因的编码序列全长为 5 73个核苷酸 (nt) ,编码产物由 190个氨基酸残基 (aa)组成。结论 :HBV前 S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要作用 ,最近的研究表明前 S1蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的免疫应答水平 ,引起病变。HBV前 S1反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究HBV前

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白l基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)前 S1蛋白(pre S1)反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法 以HBV前 S1蛋白表达质粒pcDNA3 .1(-) PreSl转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HBV前 Sl反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被前 S1蛋白反式激活 ,故命名为前Sl反式激活蛋白 1(PSlTPl) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY42 6672。PSlTPl基因的编码序列全长为64 2个核苷酸 (nt) ,编码产物由 2 13个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HBV前 Sl蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用 ,最近的研究表明前 Sl蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的应答水平 ,引起病变。HBV前 Sl反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究HBV前

EIAV反式激活蛋白(TAT)基因的分子克隆与序列测定

以马传染性贫血病毒 (EIAV)疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物 ,在病毒繁殖期提取细胞总 RNA,反转录后使用特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆、测序并与基因组全序列比较 ,确定了编码 EIAV反式激活蛋白(TAT)的转录产物及阅读框架 ,发现至少有 2种拼接产物编码 TAT。比较 2种阅读框架 ,以保守序列作为模板扩增得到完整的编码 EIAV反式激活蛋白的基因。

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选

目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5的反式调节基因. 方法:以分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5,以表达质粒pcDNA3.1(-)- NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS5ATP5后,有17条基因表达增强,12条基因表达降低. 结论:成功筛选了NS5ATP5的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP5的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

应用抑制性消减杂交技术克隆HBV全S蛋白反式激活蛋白1的反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)的反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBVCSTP1反式激活相关基因.方法:以HBVCSTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-CSTP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mKNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建入HBVCSTPl反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCK分析,均得到100-1000bp插入片段.挑取25个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得23个已知基因序列和2个未知基因.未知基因的功能还正在研究中.结论:应用SSH技术成功构建了HBVCSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBVCSTP1反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.

HIV-1反式激活蛋白介导的白血病抑制因子受体α亚基胞内区远膜端融合蛋白在HL-60细胞分化中对microRNA-155的影响

目的：探讨HIV-1反式激活蛋白（TAT）与白血病抑制因子（LIF）受体α亚基胞内区C末端序列（LIFRα-CT3）的融合蛋白（TAT-CT3）,对HL-60细胞分化的影响.方法：将HL-60细胞分为对照组和TAT-CT3组.流式细胞仪对HL-60细胞进行粒细胞表面分化标记物CD14、CD11b的检测;Real-time PCR检测HL-60细胞中BIC、miR-155及其下游靶基因C/EBP β和SOCS-1 mRNA的表达;免疫印迹检测HL-60细胞中C/EBP β、SOCS-1及pSTAT3蛋白的表达.结果：与对照组相比,TAT-CT3组的HL-60细胞,其粒细胞表面分化标记物CD14、CD11b阳性表达率增加;BIC、microRNA-155（miR-155）表达量降低,C/EBP β和SOCS-1 mRNA及蛋白表达量均增加,pSTAT3蛋白表达量降低.结论：TAT-CT3融合蛋白通过抑制miR-155的表达,促进HL-60细胞向成熟粒细胞方向分化.

丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白2在大肠埃希菌中表达及生物信息学分析

目的:构建丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白2(NS5ATP2)原核表达载体并诱导其在大肠埃希菌中表达。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以从HepG2细胞提取的mRNA为模板,扩增NS5ATP2目的基因片段,T-A克隆连接到pGEM-T载体,测序正确后将目的片段插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导NS5ATP2融合蛋白的表达,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot免疫印迹分析和证实融合蛋白的表达;以生物信息学方法对蛋白结构和功能进行预测。结果:利用RT-PCR扩增获得NS5ATP2基因片段,IPTG诱导BL21宿主菌成功表达了NS5ATP2,经SDS-PAGE和Western blot分析得到证实;生物信息学预测结果显示此蛋白富含螺旋结构,为非跨膜蛋白,无信号肽。结论:利用大肠埃希菌BL21(DE3)能够成功表达NS5ATP2蛋白,为今后研究NS5ATP2蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了的基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9与信号转导通路研究进展

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(hepatitis C virus nonstructural protein 5A tranactivator 9,NS5ATP9)参与多条信号转导通路,其可调控肝纤维化、细胞周期、肿瘤、DNA损伤修复、自噬、软骨形成和造血干祖细胞发育等生理过程。本文将对NS5ATP9基因的结构、功能以及与信号转导通路的关系进行总结,为后期对其作用机制和其他功能的深入探究奠定基础。

马传贫驴白细胞疫苗株反式激活蛋白基因的克隆与表达

马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）属于逆转录病毒科慢病毒属,由该病毒引起的马传染性贫血（简称马传贫或EIA）是马属动物的一种非常重要的传染病.该病呈世界性分布,对养马业危害极大.EIAV为正链RNA病毒,其基因组由两条相同的单链RNA组成.

应用酵母双杂交技术筛选与前S1蛋白反式激活蛋白3结合的肝细胞蛋白基因

目的用酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白反式激活蛋白3(PS1TP3)的结合蛋白。方法通过聚合酶链反应扩增获得的PS1TP3基因,构建诱饵质粒pGBKT7-PS1TP3,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在涂有X-α-Gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上进行双重筛选,提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经BglII酶切后测序,进行生物信息学分析。结果筛选出30个与PS1TP3相互作用的蛋白,其中包括泛素蛋白酶E2、丝裂原活化蛋白激酶、β2-微球蛋白、磷酸酯酶张力蛋白等已知功能基因及4个未知功能序列,以及拼接新基因1个。结论成功克隆出PS1TP3蛋白的结合蛋白,为研究PS1TP3的分子生物学功能及HBV的致病机制提供了新的思路和线索。

酵母双杂交技术筛选乙型肝炎e抗原反式激活蛋白结合蛋白的基因

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎e抗原反式激活蛋白(HBeAgTP)相互作用蛋白的基因。方法应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆HBeAg反式激活的新型靶基因HBeAgTP。用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBeAgTP基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析。结果成功克隆出HBeAgTP基因并在酵母细胞中表达,应用酵母双杂交筛选出阳性菌落24个,经生物信息学分析为15种已知基因。结论成功克隆出HBeAgTP的结合蛋白,包括一些与细胞内蛋白质的转录、翻译、免疫调节及物质和能量代谢相关的基因。

HIV-1反式激活蛋白-血红素氧合酶-1融合蛋白对大鼠供肝冷保存期肝细胞凋亡的影响

目的探讨HIV-1反式激活蛋白（transactiviting protein，TAT）与血红素氧合酶-1（heme oxygenase，HO-1）融合蛋白（TAT-HO-1）对大鼠供肝冷保存期肝细胞凋亡的影响。方法选择雄性SD大鼠48只，体重250g-300g。根据所用保存液的不同随机分为两组（n=24）：C组，肝脏应用4℃HTK液进行灌注和冷保存；P组，肝脏应用4℃含TAT-HO-150mg／L的HTK液进行灌注和冷保存。参照Kamada等的方法切取肝脏，分别于冷保存0、6、12、18h后，收集保存液，切取肝脏组织。免疫组化染色法分析TAT-HO—1转导入肝脏的情况，全自动生化分析仪测定保存液中谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平，放射免疫分析法检测肝组织中透明质酸（hyaluronic acid，HA）水平，TUNEL法检测肝实质细胞和肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cell，SECs）凋亡指数，免疫组化染色法检测肝组织Caspase-3表达情况。结果免疫组化染色结果显示P组肝组织中HO-1含量在冷保存6、12、18h时均高于C组（P〈0．05）。两组保存液中ALT水平，肝组织中HA含量，肝实质细胞和SECs凋亡率以及肝组织Caspase-3表达水平均随保存时间延长而升高（P〈0．05）。冷保存6、12、18h后保存液中ALT水平、肝组织HA含量、肝实质细胞、SECs凋亡指数以及Caspase-3阳性表达水平P组均低于C组（P〈0．05）。结论TAT-HO-1可以在冷保存期间转导进入大鼠肝脏并减轻肝实质细胞和SECs凋亡，对肝脏功能具有一定保护作用。蛋白转导技术将成为减轻肝移植冷保存期损伤的新措施。

HIV-1反式激活蛋白神经毒作用研究进展

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（human immunodeficiency virus type 1,HIV-1）感染中枢神经系统,可导致一系列临床并发症,其中最受关注的一种是艾滋病痴呆综合症（AIDS dementiacomplex,ADC）,主要表现为认知损害、精神行为异常和运动障碍。随着高效抗逆转录病毒疗法（highly active anti-retrovi-ral therapy,HAART）的出现,ADC的发病率有所降低,但该疗法并不能完全控制或逆转ADC的发展〔1〕。

Ⅱ类反式激活蛋白与免疫应答

MHCⅡ类分子在向CD4+T细胞提呈经过加工的抗原和诱发免疫反应中起重要作用。MHCⅡ类分子异常表达会引起裸淋巴细胞综合征等严重的免疫缺陷性疾病。目前已知CⅡTA是决定MHCⅡ类分子表达的主要调节因子。此外CⅡTA还影响着自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤排斥、移植耐受等。因此,Ⅱ类反式激活蛋白作为影响诸多基因的单体蛋白,在干预MHCⅡ类分子提呈抗原途径上是理想的药物治疗靶点。

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白6的亚细胞定位研究

目的研究非结构蛋白5A反式激活蛋白6（Ns5ATP6）基因在细胞内的表达及表达蛋白的亚细胞定位。方法构建HBeAgTP基因的绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-Cl-NS5ATP6，pEGFP-Cl-NSSATP6转染HepG2细胞，24h后荧光显微镜下观察蛋白表达的亚细胞定位。结果成功构建出NS5ATP6基因绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-Cl-NS5ATP6，其表达的蛋白亚细胞定位于细胞质。结论NS5ATP6基因可表达蛋白，其表达蛋白亚细胞定位于细胞质。

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5的筛选克隆与重组蛋白诱导表达

目的克隆人类乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因PS1TP5。构建其原核表达载体,并诱导其在大肠埃希菌中表达。方法以HBV前-S1表达质粒pcDNA3.1(-)-preS1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)作为平行对照,提取mRNA进行抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术分析,结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选得到人类新基因PS1TP5。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得PS1TP5基因片段,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化进BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得了PS1TP5重组蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析证实表达蛋白的特异性。结果成功扩增出PS1TP5基因。并将其插入pET-32a(+)原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了PS1TP5重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性。结论应用SSH、RT-PCR与生物信息学技术筛选克隆出PS1TP5基因,构建了pET-32a(+)-PS1TP5原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a(+)-PS1TP5重组蛋白的表达。为进一步研究PS1TP5免疫原性及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。

反式激活转录融合蛋白的研究进展

TAT是HIV-1病毒所编码的一种反式激活蛋白，具有独特的跨膜转运方式。1988年，Green和Frankel首次报道了蛋白转导现象，他们分别独立证实从HIV21病毒分离出的TAT蛋白能穿过细胞膜进入细胞㈣。TAT分子中有一个富含碱性氨基酸、具有较多正电荷的多肽片段（TAT48—60），与TAT的跨膜转导有关，被称为蛋白转导结构域（PTD）。进一步的研究发现，

和枢消积方通过调节AsTP3正反馈AKT/GSK-3β/mTOR信号通路对人肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨和枢消积方通过调节三氧化二砷反式激活蛋白3(AsTP3)对人肝癌细胞SMMC-7721增殖、凋亡的作用机制。方法:体外培养SMMC-7721肝癌细胞,采用CCK8法筛选出和枢消积方最适浓度,联合CCK8法与平板克隆形成实验检测细胞增殖,细胞划痕实验及Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力,流式细胞实验检测细胞凋亡,qRT-PCR检测细胞AsTP3 mRNA水平,Western Blot检测细胞中AsTP3、AKT、GSK-3β、mTOR蛋白相对表达量及磷酸化水平。结果:与对照组比较,和枢消积方能抑制SMMC-7721细胞增殖、迁移、侵袭及克隆能力,促进SMMC-7721细胞凋亡(P<0.05);和枢消积方可下调SMMC-7721细胞内AsTP3、P-AKT、P-GSK-3β、P-mTOR、Bcl2的mRNA表达及蛋白水平并上调Bax蛋白的表达。结论:和枢消积方能抑制SMMC-7721细胞增殖,促进其凋亡,其机制可能与下调AsTP3表达从而抑制AKT/GSK-3β/mTOR信号通路有关。

应用表达谱芯片技术对NS5ATP7反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白7(humangene7transactivatedbynonstructuralprotein5AofhepatitisCvirus,HCVNS5ATP7)的反式调节基因.方法:构建NS5ATP7基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP7,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP7转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP7后,有12条差异基因表达,其中4条基因表达增强,8条基因表达降低.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP7的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP7的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.