EIAV反式激活蛋白(TAT)基因的分子克隆与序列测定

以马传染性贫血病毒 (EIAV)疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物 ,在病毒繁殖期提取细胞总 RNA,反转录后使用特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆、测序并与基因组全序列比较 ,确定了编码 EIAV反式激活蛋白(TAT)的转录产物及阅读框架 ,发现至少有 2种拼接产物编码 TAT。比较 2种阅读框架 ,以保守序列作为模板扩增得到完整的编码 EIAV反式激活蛋白的基因。

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白2基因的克隆化研究

目的 :应用抑制性消减杂交 (SSH )技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前 S1蛋白 (pre S1)反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法 :以HBV前 S1蛋白表达质粒 pcDNA3 1( -) pre S1转染HepG2细胞 ,以空载体 pcDNA3 1( -)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HBV前 S1反式激活作用的新的靶基因。结果 :对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被前 S1蛋白反式激活 ,故命名为前 S1反式激活蛋白 2 (PS1TP2 ) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY42 6673。PS1TP2基因的编码序列全长为 5 73个核苷酸 (nt) ,编码产物由 190个氨基酸残基 (aa)组成。结论 :HBV前 S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要作用 ,最近的研究表明前 S1蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的免疫应答水平 ,引起病变。HBV前 S1反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究HBV前

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白l基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)前 S1蛋白(pre S1)反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法 以HBV前 S1蛋白表达质粒pcDNA3 .1(-) PreSl转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HBV前 Sl反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被前 S1蛋白反式激活 ,故命名为前Sl反式激活蛋白 1(PSlTPl) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY42 6672。PSlTPl基因的编码序列全长为64 2个核苷酸 (nt) ,编码产物由 2 13个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HBV前 Sl蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用 ,最近的研究表明前 Sl蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的应答水平 ,引起病变。HBV前 Sl反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究HBV前

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选

目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5的反式调节基因. 方法:以分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5,以表达质粒pcDNA3.1(-)- NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS5ATP5后,有17条基因表达增强,12条基因表达降低. 结论:成功筛选了NS5ATP5的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP5的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

应用抑制性消减杂交技术克隆HBV全S蛋白反式激活蛋白1的反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)的反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBVCSTP1反式激活相关基因.方法:以HBVCSTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-CSTP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mKNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建入HBVCSTPl反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCK分析,均得到100-1000bp插入片段.挑取25个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得23个已知基因序列和2个未知基因.未知基因的功能还正在研究中.结论:应用SSH技术成功构建了HBVCSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBVCSTP1反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.

HIV-1反式激活蛋白介导的白血病抑制因子受体α亚基胞内区远膜端融合蛋白在HL-60细胞分化中对microRNA-155的影响

目的：探讨HIV-1反式激活蛋白（TAT）与白血病抑制因子（LIF）受体α亚基胞内区C末端序列（LIFRα-CT3）的融合蛋白（TAT-CT3）,对HL-60细胞分化的影响.方法：将HL-60细胞分为对照组和TAT-CT3组.流式细胞仪对HL-60细胞进行粒细胞表面分化标记物CD14、CD11b的检测;Real-time PCR检测HL-60细胞中BIC、miR-155及其下游靶基因C/EBP β和SOCS-1 mRNA的表达;免疫印迹检测HL-60细胞中C/EBP β、SOCS-1及pSTAT3蛋白的表达.结果：与对照组相比,TAT-CT3组的HL-60细胞,其粒细胞表面分化标记物CD14、CD11b阳性表达率增加;BIC、microRNA-155（miR-155）表达量降低,C/EBP β和SOCS-1 mRNA及蛋白表达量均增加,pSTAT3蛋白表达量降低.结论：TAT-CT3融合蛋白通过抑制miR-155的表达,促进HL-60细胞向成熟粒细胞方向分化.

丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白2在大肠埃希菌中表达及生物信息学分析

目的:构建丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白2(NS5ATP2)原核表达载体并诱导其在大肠埃希菌中表达。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以从HepG2细胞提取的mRNA为模板,扩增NS5ATP2目的基因片段,T-A克隆连接到pGEM-T载体,测序正确后将目的片段插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导NS5ATP2融合蛋白的表达,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot免疫印迹分析和证实融合蛋白的表达;以生物信息学方法对蛋白结构和功能进行预测。结果:利用RT-PCR扩增获得NS5ATP2基因片段,IPTG诱导BL21宿主菌成功表达了NS5ATP2,经SDS-PAGE和Western blot分析得到证实;生物信息学预测结果显示此蛋白富含螺旋结构,为非跨膜蛋白,无信号肽。结论:利用大肠埃希菌BL21(DE3)能够成功表达NS5ATP2蛋白,为今后研究NS5ATP2蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了的基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9与信号转导通路研究进展

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(hepatitis C virus nonstructural protein 5A tranactivator 9,NS5ATP9)参与多条信号转导通路,其可调控肝纤维化、细胞周期、肿瘤、DNA损伤修复、自噬、软骨形成和造血干祖细胞发育等生理过程。本文将对NS5ATP9基因的结构、功能以及与信号转导通路的关系进行总结,为后期对其作用机制和其他功能的深入探究奠定基础。

马传贫驴白细胞疫苗株反式激活蛋白基因的克隆与表达

马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）属于逆转录病毒科慢病毒属,由该病毒引起的马传染性贫血（简称马传贫或EIA）是马属动物的一种非常重要的传染病.该病呈世界性分布,对养马业危害极大.EIAV为正链RNA病毒,其基因组由两条相同的单链RNA组成.

应用酵母双杂交技术筛选与前S1蛋白反式激活蛋白3结合的肝细胞蛋白基因

目的用酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白反式激活蛋白3(PS1TP3)的结合蛋白。方法通过聚合酶链反应扩增获得的PS1TP3基因,构建诱饵质粒pGBKT7-PS1TP3,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在涂有X-α-Gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上进行双重筛选,提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经BglII酶切后测序,进行生物信息学分析。结果筛选出30个与PS1TP3相互作用的蛋白,其中包括泛素蛋白酶E2、丝裂原活化蛋白激酶、β2-微球蛋白、磷酸酯酶张力蛋白等已知功能基因及4个未知功能序列,以及拼接新基因1个。结论成功克隆出PS1TP3蛋白的结合蛋白,为研究PS1TP3的分子生物学功能及HBV的致病机制提供了新的思路和线索。

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5的筛选克隆与重组蛋白诱导表达

目的克隆人类乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因PS1TP5。构建其原核表达载体,并诱导其在大肠埃希菌中表达。方法以HBV前-S1表达质粒pcDNA3.1(-)-preS1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)作为平行对照,提取mRNA进行抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术分析,结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选得到人类新基因PS1TP5。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得PS1TP5基因片段,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化进BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得了PS1TP5重组蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析证实表达蛋白的特异性。结果成功扩增出PS1TP5基因。并将其插入pET-32a(+)原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了PS1TP5重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性。结论应用SSH、RT-PCR与生物信息学技术筛选克隆出PS1TP5基因,构建了pET-32a(+)-PS1TP5原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a(+)-PS1TP5重组蛋白的表达。为进一步研究PS1TP5免疫原性及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。

反式激活转录融合蛋白的研究进展

TAT是HIV-1病毒所编码的一种反式激活蛋白，具有独特的跨膜转运方式。1988年，Green和Frankel首次报道了蛋白转导现象，他们分别独立证实从HIV21病毒分离出的TAT蛋白能穿过细胞膜进入细胞㈣。TAT分子中有一个富含碱性氨基酸、具有较多正电荷的多肽片段（TAT48—60），与TAT的跨膜转导有关，被称为蛋白转导结构域（PTD）。进一步的研究发现，

肌钙蛋白I2辅助活化多种核受体的反式作用

为深入研究乳腺癌中孤儿受体ERRα1参与基因表达调控的详细机理,特别是核受体辅激活蛋白在其中的作用,以ERRα1的LBD为诱饵,用酵母双杂交系统筛选人乳腺组织cDNA文库得到了与其有明显相互作用的快速骨骼肌型肌钙蛋白I(TNNI2).应用酵母双杂交技术研究表明,TNNI2与多种核受体存在相互作用,且这种作用依赖于功能性的核受体AF2结构域.在哺乳细胞瞬时共转染实验中,TNNI2显示了对多种核受体反式激活功能的辅助活化作用.研究证明,TNNI2与许多辅激活蛋白类似,以配体依赖(对类固醇激素受体而言)或非依赖(对孤儿受体而言)的方式与核受体功能性AF2结构域相互作用,并增强多种核受体介导的反式作用.

B细胞特异性激活蛋白研究进展

B细胞特异性激活蛋白（BSAP）是近年来新发现的B细胞核反式作用因子，属转录因子的pax基因家族成员，其蛋白结构已经清楚。在淋巴系统内，仅B细胞可产生这一因子，其功能是在B细胞发育早期，调节B细胞多种特异性基因表达；B细胞被激活后、促进B细胞的增殖及同型转换。但BSAP对免疫球蛋白的基因转录起抑制作用，因此，在B细胞分化晚期，BSAP水平下降时，可使免疫球蛋白分泌增加。

TAT-Apoptin融合蛋白分泌表达载体的构建及其活性检测

目的构建具有自主跨膜能力的Apoptin融合蛋白表达载体,使其分泌表达,避开包涵体复性,简化制备工艺。方法人工合成反式激活蛋白(TAT)序列,与Apoptin序列融合,连接到pET22b+载体上,构建原核分泌表达载体pET22b+-TAT-Apoptin,IPTG诱导目的蛋白分泌表达到大肠杆菌周质空间,提取蛋白行SDS-PAGE分析,MTT法检测分泌表达的融合蛋白对胃癌823细胞的抑制作用。结果重组TAT-Apoptin蛋白可分泌至大肠杆菌周质空间中,以可溶状态存在,对胃癌823细胞的最大抑制率为83.95%。结论成功构建重组TAT-Apoptin蛋白表达载体,分泌表达的可溶性融合蛋白具有生物活性。

HIV-Tat蛋白转导域在医学研究中的应用

HIV Tat蛋白转导域 (proteintransductiondomain ,PTD)是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域 ,它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞 ,甚至可以通过血脑屏障 ,转导效率很高而且对细胞没有损伤。TAT融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具 。

人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体的构建

目的构建人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体。方法以人胰腺癌(PANC)-1细胞株cDNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增胰腺十二指肠同源异型盒基因-1(PDX-1)蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a中,经限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切及DNA序列分析重组质粒的目的基因。结果 RT-PCR扩增产物的特异性片段长度为885 bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-PDX-1经HindIII和BamHI双酶切后显示5 900 bp和885 bp左右的2条片段,测序结果与Genbank中的人PDX-1基因cDNA序列一致。结论成功构建了人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体。