融合蛋白GST-反式转录激活因子蛋白-增强型绿色荧光蛋白表达及对血迷路屏障作用

目的表达并纯化融合蛋白GST-反式转录激活因子蛋白-增强型绿色荧光蛋白(GST-transactivator of transcription-enhanced green f luorescence protein,GSTTAT-EGF P),并研究其是否能跨越血迷路屏障(blo o d labyrinth barrir,BLB)进入内耳。方法用基因重组技术将编码TAT蛋白11个氨基酸短肽基因和EGFP基因重组,分别构建p GEX-6p-1-TAT-EGFP和p GEX-6p-1-EGFP表达载体,将载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,用GST树脂柱亲和层析纯化融合蛋白。将10只豚鼠随机分为两组,分别肌肉注射GST-EGFP和GST-TATEGFP;2~4 h后豚鼠经麻醉、断头取耳蜗等组织。用2%多聚甲醛固定,耳蜗经10%EDTA(p H7.4)脱钙、OCT包埋,制备颞骨冰冻切片,采用免疫组化技术和荧光显微镜技术观察TAT短肽是否可以携带分子量55 k D的GST-EGFP跨越BLB进入内耳。结果 GST-TAT-EGFP进入内耳后主要分布于血管纹和螺旋器,而对照组EGFP不能进入内耳。结论短肽TAT可转导大分子蛋白通过BLB进入内耳,为外源性蛋白药物治疗内耳疾病提供新手段。

HBVX蛋白真核表达质粒的构建及其对反式转录激活作用的影响

目的 构建HBVX蛋白真核表达质粒并了解其对反式转录激活作用的影响。方法 用亚克隆方法构建HBVX蛋白真核表达质粒 ,以氯霉素乙酰转移酶转化率分析 (CAT试验 )揭示HBX蛋白的反式转录激活作用。结果 HBVX蛋白真核表达质粒转染HepaG2细胞后 ,以WesternBlot检测发现 2 μg、5 μg和 10 μg的 p5SGUTPLHBXDNA均能有效表达 ;CAT试验揭示 2 μg、5 μg、10μg的 p5SGUTPLHBXDNA对报道基因 pHE2×CAT的14 C -标记乙酰化氯霉素转化率分别为 (4 5 .5± 2 5 .9) %、(6 5 .6± 14.4) %和 (6 8.8± 19.7) %。

反式转录激活因子-氨基端24个氨基酸穿膜融合多肽对结直肠癌血管形成的影响

目的 观察反式转录激活因子-氨基端24个氨基酸（TAT-N24）穿膜融合多肽对结直肠癌血管形成的影响.方法 对结直肠癌细胞Lovo过表达p55PIK和/或同时给予p55PIK的特异性抑制剂TAT-N24后,通过Western blot法检测乏氧诱导因子-1α的表达,通过双荧光素酶报告系统检测血管内皮生长因子-A的启动子活性,并用酶联免疫吸附试验检测其蛋白分泌,最后通过体外血管形成实验检测p55PIK及TAT-N24对结直肠癌血管形成的影响.结果 过表达p55PIK促进结直肠癌细胞株Lovo中乏氧诱导因子-1α的表达,进而增强血管内皮生长因子-A的启动子活性（p55PIK组比对照组,常氧：9.1±1.1比1.0±0.2,乏氧：14.5 ±1.6比1.0±0.3）,并且促进其在培养基上清中的分泌[p55PIK组比对照组,常氧：（412±23） mg/L比（150±18） mg/L,乏氧：（859±203） mg/L比（233±12） mg/L],而且其条件培养基可促进脐静脉内皮细胞形成血管,而TAT-N24可拮抗上述过程,抑制结直肠癌的血管形成.结论 p55PIK可促进结直肠癌的血管形成,而TAT-N24作为其特异性抑制剂,可抑制结直肠癌的血管形成.

人类免疫缺陷病毒-反式转录激活因子蛋白在心血管疾病中的作用研究现状

人免疫缺陷病毒(HIV)-反式转录激活因子(Tat)蛋白是人类免疫缺陷病毒I型(HIV^(-1))基因所编码的一种反式转录激活因子,在HIV复制和HIV感染相关的扩张型心肌病、动脉粥样硬化、冠心病和长QT间期综合征等心血管系统疾病的发生发展中起重要调控作用。HIV-Tat蛋白的蛋白转导域具有穿膜特性,可将外源性生物学分子携带进入多种哺乳动物细胞,且不具有细胞毒性。为此HIV-Tat蛋白的这一功能可应用到药物转运及疾病治疗等领域,这为生物学研究开辟了一条新途径。本文对HIV-Tat蛋白在HIV相关的心血管系统疾病中的作用和机制以及在医学相关领域中的研究现状进行了综述。

反式转录激活因子蛋白转导技术在缺血性脑卒中中的应用进展

背景蛋白转导结构域（protein transducer domain，PTD）使大分子药物可以通过血脑屏障（blood brain barrier，BBB），受到了日益广泛地关注。目的以应用最为广泛的反式转录激活因子（transactivator of transcription，TAT）蛋白转导结构域为核心，通过总结其在神经系统疾病中的作用及机制，为相关领域研究提供参考。内容TAT蛋白转导结构域是人类I型免疫缺陷病毒（human immunodeficiencv virus-1，HIV-1）的功能性结构域。目前已与红细胞生成素（erythropoietin，EPO）、胶质细胞源神经营养因子（glial cell line-derivedn eurotrophic factor，GDNF）、Nogo-A细胞外肽140（nogo extracellular peptide1-40，NEP1-40）、抗凋亡蛋白等多种功能性蛋白重组融合，不仅使其透过BBB发挥神经保护作用，还减少了药物副作用。尤其是突触后致密物蛋白-95（synapses dense protein-95，PSD-95）融合形成的TAT-NR289c可减少脑梗死容积，改善神经功能，已完成Ⅱ期临床试验。趋向TAT蛋白转导技术在神经系统疾病的治疗中具有显著优势，为临床治疗脑卒中的新药研发提供了新的方向。

可调控表达人博卡病毒1型非结构蛋白NS1稳定细胞系的建立及其反式转录激活作用初探

人博卡病毒1型(Human bocavirus 1,HBoV1)非结构蛋白NS1是多功能蛋白,对病毒复制有重要作用,同时可诱导宿主细胞凋亡。在研究NS1蛋白功能时,降低NS1蛋白对宿主细胞的毒性作用是急需解决的问题。基于此,文中建立了可调控表达HBoV1非结构蛋白NS1的稳定细胞系。构建NS1重组慢病毒质粒(含可调控启动子),应用转染试剂将NS1重组慢病毒质粒转染至HEK293T细胞。通过嘌呤霉素筛选抗性细胞、多西环素诱导NS1表达,建立可稳定表达NS1-100、NS1-70蛋白的HEK 293T细胞系,利用荧光标记蛋白和Western blotting检测,确定NS1蛋白的表达。并在稳定表达NS1细胞系中转染HBoV1启动子-荧光素酶基因的质粒,分析NS1的反式转录激活活性。结果表明NS1蛋白可在建立的细胞系中稳定表达,且稳定表达NS1蛋白对HBoV1启动子有较强的激活活性,为进一步研究非结构蛋白NS1的功能及人博卡病毒致病机理奠定了良好的基础。

反式激活转录融合蛋白的研究进展

TAT是HIV-1病毒所编码的一种反式激活蛋白，具有独特的跨膜转运方式。1988年，Green和Frankel首次报道了蛋白转导现象，他们分别独立证实从HIV21病毒分离出的TAT蛋白能穿过细胞膜进入细胞㈣。TAT分子中有一个富含碱性氨基酸、具有较多正电荷的多肽片段（TAT48—60），与TAT的跨膜转导有关，被称为蛋白转导结构域（PTD）。进一步的研究发现，

牛泡沫病毒反式激活因子在内部启动子上应答元件的研究

泡沫病毒的基因转录依赖至少两个不同的启动子 :LTR调节病毒结构蛋白的表达 ,而内部启动子 (IP)则起始调节蛋白mRNA的转录。牛泡沫病毒 (BFV)在env与 3′LTR之间有两个重叠的开放阅读框架orf 1和orf 2 ,分别编码BFVORF 1、ORF 2等多种调节蛋白。这些蛋白中BFVORF 1为转录激活因子 ,称为Tas。Tas对LTR及IP均有反式激活作用。BFV中第二类启动子IP的存在反映了泡沫病毒基因调控的复杂性。已从BFV3 0 2 6中国毒株中克隆了基因组区段 85 72～ 95 0 9,并通过测序和功能分析证明该区段包含了BFVIP。为了对IP进行更精确的定位 ,对其进行了进一步的缺失分析 ,将完整的IP定位在 9117～ 940 5之间。该启动子的TATA盒位于 912 80～92 85 ,是IP必不可少的元件之一。杂合启动子和缺失分析表明 ,TATA盒上游 16 0bp的区域内包含了IP的Tas应答元件 (TREIP) ,其功能类似于增强子。Tas对IP具有强烈的激活作用 ,而C端缺失的ORF 1蛋白或ORF 2蛋白均不足以激活IP的表达。

HIV-1反式激活抑制剂的研究进展

转录反式激活因子(Tat)在HIV-1的转录和复制过程中起着十分重要的调节作用。Tat蛋白与反式激活应答区(TAR)RNA及正向转录延伸因子(P-TEFb)形成三元复合物,不仅促使转录完全,并且显著提高转录效率。Tat蛋白对HIV-1转录水平的重要调控作用及其结构的高度保守使它成为研究抗艾滋病药物的新靶点。该文将简要介绍HIV-1 Tat介导的反式激活过程,并对近年报道的以TAR、Tat和P-TEFb为靶点的小分子抑制剂进行综述。

重组蛋白PTD-HSP27的制备及其穿细胞膜和角膜组织的功能研究

目的:制备PTD-HSP27蛋白并研究其能否穿过人晶状体上皮细胞SRA01/04细胞膜及新西兰大白兔的角膜组织进入眼前房。方法:利用重叠延伸PCR法获得重组目的基因片段PTD-HSPB1-6His,构建重组质粒p KYB-PTD-HSP27-6His,原核诱导PTD-HSP27蛋白表达及纯化重组蛋白后对其进行Western blotting鉴定;用异硫氰酸荧光素(FITC)标记重组蛋白PTD-HSP27并检测其穿透SRA01/04细胞膜的能力及兔眼角膜组织的能力。结果:成功构建并纯化制备目的蛋白PTD-HSP27,在PTD-HSP27孵育后的SRA01/04细胞及结膜囊滴注PTDHSP27兔眼前房内均可检测出重组蛋白PTD-HSP27。结论:通过重叠延伸PCR法及镍柱层析纯化法可以获得较纯的重组蛋白PTD-HSP27;重组蛋白PTD-HSP27能够穿透SRA01/04细胞膜及穿越兔眼角膜进入房水。

pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得pTAT-XIAP融合蛋白;为其用于神经系统疾病的治疗奠定基础。方法体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,转入大肠杆菌表达菌株BL21plysS进行诱导表达。SDS-PAGE及Western blot法鉴定融合蛋白。结果表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,于64 kD处有一明显表达条带,与理论结果相符。结论成功构建了pTAT-XIAP原核表达载体并成功表达出目的融合蛋白,该载体成功表达pTAT-XIAP融合蛋白,有望用于临床神经系统疾病的治疗。

TAT-LHRH-壳聚糖/siRNA纳米复合物与巨噬细胞的相互作用

目的评价反式转录激活因子短肽-促黄体生成激素释放激素(TAT-LHRH)修饰的低分子质量壳聚糖(LMWC)作为siRNA载体的生物安全性。方法利用琥珀亚酰胺基-3-2-硫代吡啶-丙酸酯(SPDP)共价连接TAT-LHRH双功能肽及LMWC(相对分子质量5 000~8 000;脱乙酰化程度90%),合成TAT-LHRH-壳聚糖(TLC)载体,并与未修饰的LMWC分别和非编码siRNA(序列5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)混合,合成TLC/siRNA纳米复合物和LMWC/siRNA纳米复合物。利用凝胶阻滞及光散射实验观察纳米粒的表征,并通过酶联免疫吸附分析(ELISA)、流式细胞术及体内巨噬细胞吞噬实验分析纳米复合物诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7所引起的细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)的变化,以及对人巨噬细胞吞噬活性的影响。结果与未进行任何修饰的壳聚糖相比,TLC具有更好的siRNA结合能力(N/P比分别为1∶2、1∶1、2∶1、5∶1和10∶1)。以不同N/P(10∶1、20∶1)与siRNA形成纳米复合体后,其粒径分布于90~150 nm,zeta电位稳定在+2.7^+19.3 m V。含200 nmol/L siRNA的TLC/siRNA纳米复合物在24 h内未引起上述细胞因子的明显释放。体内与体外的巨噬细胞吞噬实验证明,相比未修饰壳聚糖/siRNA复合物而言,TLC/siRNA纳米复合物被巨噬细胞摄入量更高,但两者均未对吞噬活性和细胞因子生成产生明显影响。结论 TLC无明显免疫毒性,是一种有应用前景的siRNA载体。

HIV-1 Tat对小鼠脑微血管紧密连接蛋白claudin 5及Aβ转运蛋白的作用研究

目的:探讨HIV-1反式转录激活因子(HIV-1 Tat)诱导小鼠脑微血管紧密连接蛋白整合膜蛋白5(claudin 5)及β淀粉样蛋白(Aβ)转运蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)、晚期糖基化终产物受体(RAGE)的表达变化及其相互关系。方法:将18只8周龄C57BL/6小鼠随机分成对照组和HIV-1 Tat组,每组9只。对照组静脉注射100μL生理盐水;HIV-1 Tat组静脉注射HIV-1 Tat(100μg/kg)100μL。组织匀浆法测定脑内伊文思蓝(EB)的泄漏量,行蛋白免疫印迹法(WB)及实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测小鼠脑微血管claudin 5、LRP-1和RAGE蛋白及mRNA表达。结果:与对照组相比,HIV-1 Tat组小鼠脑EB泄漏量显著增加(P<0.05);小鼠脑微血管claudin 5、LRP-1蛋白和mRNA水平显著下调(P<0.05),RAGE蛋白和mRNA水平上调(P<0.05);claudin 5与LRP-1蛋白水平呈正相关关系(r=0.886,P<0.05),而与RAGE蛋白水平呈负相关关系(r=-0.943,P<0.05)。结论:HIV-1 Tat通过下调claudin 5表达增加BBB通透性,而通过下调LRP-1表达减少Aβ从脑内向血液中转运及上调RAGE表达增加Aβ脑内转运。

口服型重组草鱼生长激素基因的创建及其原核表达最佳条件研究

生长激素是脊椎动物分泌的一种多肽激素,具有调节鱼类生长发育和代谢等作用.本研究通过将反式转录激活因子(TAT,Trans-activating transcriptional activator)、草鱼生长激素(GH,growth hormone)和细胞穿透环肽(CP,cyclic peptides)等三个基因片段,柔性拼接成一种新型口服型渔用生长激素基因(TGC)并构建其原核表达载体,再将其转化至表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中,获得基因工程菌(TGC-DE3),并对该基因工程菌原核表达条件进行优化.结果表明,柔性拼接后得到的TGC基因片段完整并正向整合到表达载体,TGC-DE3基因工程菌能诱导表达得到分子质量约34.0 kDa的目的蛋白.当IPTG浓度为0.05 mmol/L,诱导温度为37℃,诱导转速为100 rpm,诱导表达到最佳时间1.5 h时,目的蛋白表达量最高.本研究为渔用生长激素的使用从注射走向口服提供了可能,也为口服型草鱼生长激素蛋白的规模化原核表达生产提供了技术支持.

Tat翻译后修饰调控HIV-1的转录

HIV-1病毒感染机体靶细胞后,可通过一系列调控蛋白和辅助蛋白来改变宿主环境,以逃避免疫反应和促进病毒复制。调控蛋白Tat在病毒初始转录阶段与多种转录辅助因子相互作用,控制HIV-1基因组转录和潜伏期病毒的激活等,被称为HIV-1的反式转录激活因子。翻译后修饰是一种可逆过程,在Tat与不同转录辅助蛋白之间扮演了至关重要的角色。磷酸化可以促进Tat与TAR RNA结合,乙酰化能够巩固Tat/P-TEFb/TAR RNA复合体的形成,或增加染色质修饰和重塑,增强HIV-1基因组转录起始。Tat发生泛素化修饰可导致其表达下降并阻断转录,也可表现为其水平的稳定。Tat甲基化后对转录的影响不同,甚至完全相反。因此,这可能成为逆转录病毒复制和传播的潜在靶点。本文就Tat在HIV-1基因组转录和复制中涉及蛋白质磷酸化、乙酰化、泛素化和甲基化修饰方面的研究进展进行总结,以促进人们对Tat翻译后修饰与HIV-1转录机制的理解,并为抗HIV转录的新型药物发掘奠定理论基础。

HIV-1 B、C亚型Tat第41位赖氨酸对HIV-1转录活化的影响

目的对反式转录激活因子Tat第41位赖氨酸(K41)在HIV-1转录活化过程中的作用进行探讨,并对B、C亚型HIV-1中Tat K41的作用进行比较。方法通过荧光素酶活性实验检测野生型Tat、突变型Tat K41A、Tat K41R对HIV-1转录活性的影响,并比较B、C亚型HIV-1中Tat K41作用的差异;通过免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)实验检测B、C亚型HIV-1中Tat K41是否影响Tat与SIRT1的结合;通过Western blot检测细胞核内B、C亚型HIV-1的Tat K41是否影响p65 K310的乙酰化水平。结果与B亚型HIV-1不同,C亚型HIV-1的Tat K41突变后显著降低荧光素酶活性,减弱C亚型Tat与SIRT1的结合,降低细胞核内p65 K310ac的水平。结论C亚型Tat K41在HIV-1转录中发挥重要作用。

2H-1,4-苯并二氮-2-酮类HIV-1转录抑制剂的设计、合成及活性研究

转录反式激活因子(trans-activator of transcription,Tat)在HIV-1的转录中起着重要的调控作用,针对HIV-1 Tat中的β-转角结构,采用2H-1,4-苯并二氮-2-酮作为β-转角肽链骨架的模拟结构,分别以对硝基氯苯/苯乙腈、对甲基苯胺/苯甲酰氯以及硝西泮为起始原料,采用不同合成路线得到了19个2H-1,4-苯并二氮-2-酮类化合物(10～18、21～24、26～31)。初步活性评价表明,化合物30在没有明显细胞毒作用的浓度下对Tat介导的荧光素酶的表达显示了较好的抑制作用,其半数有效浓度EC50为25.0μmol·L-1。

TAT—XIAP融合蛋白对学习记忆障碍大鼠的影响及其机制

目的探讨TAT—XIAP融合蛋白对学习记忆障碍大鼠的影响及其与大脑海马神经元凋亡的关系，为学习记忆的深入研究提供实验依据。方法利用基因工程技术制备具有生物学活性的TAT-XIAP融合蛋白，通过D-半乳糖（D—Gal）腹腔注射和AIM-42海马注射建立学习记忆障碍大鼠模型，将大鼠随机分为TAT—XIAP组（左侧脑室注射TAT—XIAP融合蛋白，每天80mg／kg，共3d）和模型组（侧脑室注射等体积PBS）各30只，采用水迷宫评价大鼠的学习记忆能力，TUNEL法检测大鼠海马神经元凋亡。结果1TAT—XIAP组大鼠在各象限入水至爬上平台的时间均明显缩短，平均值为（48．31±9．44）s，明显低于模型组的（87．80±10．32）S（P〈0．05）；TAT—XIAP组大鼠穿越平台的次数、在原平台象限游程百分比、在原平台象限时间百分比均明显增加，分别为（4．78±0．93）次、（47．39±5．84）％、（48．43±5．75）％，与模型组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。2TAT．XIAP组大鼠海马凋亡神经元明显减少，凋亡神经元计数为（16．37±3．15）个／mm^2，模型组为（54．66±7．20）个／mm^2，两者差异有统计学意义（P〈0．05）。结论TAT—XIAP融合蛋白可明显改善学习记忆障碍大鼠学习记忆功能，其机制可能与大鼠海马神经元凋亡减少有关。