黄瓜花叶病毒反式遗传复制体系的构建

为了确定复制酶1a在寄主植物中的含量对黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)基因组复制的影响,在本氏烟中瞬时表达CMV复制酶1a和2a,构建CMV的反式复制遗传体系,分析1a蛋白不同表达水平对基因组R3-gfp的影响。结果显示:瞬时表达载体pCB301在寄主植物中表达1a和2a蛋白能复制CMV基因组R3-gfp;在1a2aR3-gfp侵染本氏烟中RNA3和RNA4含量低于R1R2R3-gfp,1a2aR3-gfp复制的效率低于R1R2R3-gfp;在1a2aR3-gfp浸润接种的植物中,1a浓度接种提高,CMV基因组RNA3和RNA4复制受到抑制。该构建反式遗传复制体系为进一步研究CMV复制的分子机理提供实验材料以及理论依据。

乙型肝炎病毒前-S2蛋白反式激活蛋白1基因的克隆化研究

目的应用基因表达谱芯片技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法以HBV前-S2蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-PreS2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取总RNA进行基因表达谱芯片分析。并克隆HBV前-S2反式激活作用的新的靶基因。结果获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被前-S2蛋白反式激活,故命名为前S2反式激活蛋白1(PS2TP1),已在GenBank中注册,注册号:AY561706。PS2TP1基因的编码序列全长为1113个核苷酸(nt),编码产物由370个氨基酸残基(aa)组成。结论HBV前-S2蛋白具有反式激活功能,调节宿主细胞某些基因的表达,从而改变宿主正常的应答水平,引起病变。

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A反式激活基因NS4ATP1的克隆化研究

目的:筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4A(NS4A)反式激活新型靶基因。方法:以HCVNS4A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选得到的克隆,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,通过序列同源性比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染pcDNA3.1(-)-NS4A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果:该新基因的编码序列全长为963个核苷酸(nt),编码产物由321个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为NS4ATP1,在GenBank中注册,注册号为AY 740521。结论:分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV非结构蛋白反式激活作用的新型靶基因NS4ATP1,为进一步研究HCV非结构蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。

B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白对MDR1基因反式激活能力的比较

目的研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对多药耐药基因1(MDR1)反式激活能力的差别。方法PCR扩增B、C基因型HBVX基因并克隆于pcDNA3.1/HisC载体(重组载体分别为pcDNA3.1/HisC-XB及pcDNA3.1/HisC-XC)。以FuGENE6将重组表达载体转染HepG2细胞,采用融合表达的X-press多肽表位抗体,通过Westernblot检测目的蛋白在不同时间段的表达。PCR扩增MDR1基因启动子并克隆于萤火虫荧光素酶报告载体pGL3-Basic(重组载体为pGL-MDR)。pGL-MDR分别与pcDNA3.1/HisC-XB或pcDNA3.1/HisC-XC共转染HepG2细胞,转染后48h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性。实验数据以SPSS11.5软件分析。结果成功克隆X蛋白表达载体及MDR1报告载体。Westernblot显示pcDNA3.1/HisC-XB或pcDNA3.1/HisC-XC在HepG2细胞中均能表达HBVX蛋白,以转染后48h为最高。当pGL-MDR报告质粒与X基因重组载体或空载体质量比在1:2～1:4范围内,萤火虫荧光素酶在各转染细胞内的活性依次为pcDNA3.1/HisC-XB+pGL-MDR组>pcDNA3.1/HisC-XC+pGL-MDR组>pcDNA3.1/HisC+pGL-MDR组(对照组),且存在剂量-效应关系。结论B、C基因型HBVX蛋白对多药耐药基因均有反式激活能力,且B基因型强于C基因型。

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白 (core)反式激活的新型靶基因。方法 以HCV核心蛋白表达质粒pcD NA3 1(- ) core转染HepG2细胞 ,以空载体 pcDNA3 1(- )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选出来的基因 ,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对及电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从转染 pcDNA3 1(- ) core的HepG2细胞提取总RNA ,以RT PCR技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为 2 0 0 1nt,编码产物由 6 6 7aa组成 ,并测序证实 ,命名为TAHCCP1,在GenBank中注册 ,注册号为AY0 3835 9。结论 发现并鉴定、克隆了HCV核心蛋白反式激活作用的新型靶基因TAHCCP1。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B(HCV NS5B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交(SSH)分析.随机挑取克隆进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到35个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析,显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS5B反式激活靶基因.结论:成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.

ERα AF-1区磷酸化位点突变体的构建及对ERα活性的影响

目的:构建雌激素受体(ERα)AF1区丝氨酸(Ser)磷酸化位点104、106、118和167位氨基酸的4个突变体,并在哺乳动物细胞293T中检测突变后对其活性的影响。方法:以pcDNA3-ERα为模板,用重组PCR的方法扩增出编码这4种突变体的基因片段,再将这些片段以正确相位与pcDNA3-FLAG载体中的FLAG编码序列融合。用Western blotting检测融合蛋白的表达,并在哺乳动物细胞293T中检测这些突变体突变后对ERα活性的影响。结果:成功构建了ERαAF1区丝氨酸磷酸化位点104、106、118和167位氨基酸的4个突变体,并在293T细胞中得到表达。活性测定结果表明,在不加雌激素(E2)的情况下,ERα及其突变体的转录活性分别是空载体pcDNA3的3.40、3.21、3.02、3.00和3.54倍;在雌激素的作用下,104、106位氨基酸的突变体对ERα的活性无影响,而118和167位氨基酸的突变体的活性值是ERα的50%。结论:在104、106、118和167这4个ERαAF1区磷酸化位点中,只有118和167位点的丝氨酸的磷酸化是雌激素调节靶基因转录过程中所必需的。

慢性乙型肝炎外周血HBV—LHBs反式激活功能与抗病毒疗效关系的研究

目的探究慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒外膜大蛋白分子（HBV．LHBs）反式激活功能与慢性乙型肝炎抗病毒治疗疗效关系。方法对60例抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者采取每3个月进行HBV DNA、HBV-LHBs以及乙肝免疫标志物检测观察各指标间的变化。结果入组时60例抗病毒组HBVDNA与HBV-LHBs检出率有较高的一致性检出结果，无统计学意义（P〉0．05），HBV—LHBs阳性率与HBeAg阳性率存在差异（χ^2=4．08，P〈0．05）。经过24个月抗病毒治疗HBV-LHBs始终表达者29例，其中HBV DNA在24个月里出现转阴后反弹的20例、HBV DNA持续阳性未转阴者7例。60例患者24个月里未发现HBsAg血清转换，4例出现HBeAg血清转换。结论（1）血清HBV—LHBs检测能够反映出乙肝病毒的复制情况与HBV DNA具有较好的相关性。（2）抗病毒治疗过程中动态观察HBV-LHBs的表达能够预测抗病毒治疗的有效性。

抑制雌激素调控的靶基因LRP16表达能削弱ERα介导的转录激活活性

目的:探讨抑制雌激素(E2)调控的靶基因LRP16表达对雌激素受体α(ERα)介导转录激活活性的影响。方法:将针对LRP16合成的小于扰RNA,与ERα表达载体、雌激素反应性元件荧光素酶报道载体(pGL-3-S10或3×ERE-Luc)共转染乳腺癌细胞MCF-7,双荧光素酶检测方法测定pGL-3-S10或3×ERE-Luc报道子的相对荧光素酶活性;E2刺激培养已建立的稳定抑制LRP16表达的MCF-7细胞,Northern blot方法检测比较具有不同LRP16表达水平的MCF-7细胞中ERα下游靶基因对E2的反应性变化。结果:抑制LRP16表达降低了ERα对其反应性报道子(pGL-3-S10和3×ERE-Luc)的激活活性;同时也降低了ERα下游靶基因对E2的反应性上调效应,其中包括E2F1、维甲酸受体α(RARα)、c-fos、cyclin D1和MTA3,但对cathepsin D的表达无影响。结论:抑制ERα靶基因LRP16的表达可以下调ERα介导的转录激活活性,表明LRP16对ERα信号转导通路具有反馈增强效应,提示LRP16在ERα阳性的乳腺癌发生与进展中应有重要作用。

丙型肝炎病毒F反式调节靶基因反式激活基因的筛选和生物信息学分析

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F反式调节靶基因FTP2的反式激活基因的cDNA文库,克隆FTP2反式激活基因。方法以HCV FTP2表达质粒pcDNA3．1(-)-HCV FTP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照；制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成两组．分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克降PCR后进行测序及同源源性分析。结果成功构建人HCV FTP2反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200～1000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中24个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得20种编码基因,其中1个为未知功能的新基因。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白4A（HCV NS4A）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS4A蛋白反式激活相关基因。方法以HCV NS4A表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染Hep G2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行SSH分析。将富集的二次PCR产物与TIA载体连接，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑取克隆，聚合酶链反应（PCR）扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到36个阳性克隆，经菌落PCR分析显示200～1000bp插入片段。对其中的25个片段测序，并进行同源性分析，显示18种已知基因编码蛋白和2种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS4A反式激活靶基因。结论成功构建了HCV NS4A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS4A反式调节的靶基因等提供了相关的平台。

脓毒症大鼠肝损伤与信号传导和转录激活子的关系

目的:探讨信号转导和转录激活子(signaltransducerandactivatoroftranscription,STAT)与严重感染性休克大鼠肝组织和血浆白介素-6(IL-6)表达及组织炎症的关系。方法:采用大鼠盲肠结扎穿孔术(CLP)模型制造腹腔感染,随机将56只大鼠分为正常组、CLP组和CLP+STAT抑制剂(RPM)处理组。采用逆转录多聚酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测试剂盒分别测定血浆和肝IL-6mRNA和蛋白水平;生化方法测定血浆转氨酶(AST),HE染色病理切片检测肝组织炎症反应程度。结果:与正常大鼠相比,CLP后各时间点肝和血浆IL-6mRNA、蛋白含量均升高明显;同时AST显著升高,病理学评分显著升高。STAT抑制剂处理后,与CLP组相应时间点相比,CLP后血浆AST和肝病理学评分均显著下降;但肝IL-6mRNA表达和血浆IL-6蛋白含量未见明显变化。结论:抑制STAT活化可缓和脓毒症所致肝组织炎症反应,减轻肝组织损伤;这一作用可能与STATI抑制剂(RPM)通过抑制STAT的激活而调节IL-6及其它炎症介质表达相关。

抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA,克隆HCV F蛋白反式激活相关基因。方法以HCV F表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1 (-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HCV F蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200-1000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中28个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得19种编码基因,其中2个为未知功能的新基因。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。

Plastid Inheritance in Sweet Potato as Revealed by DNA Restriction Fingerprinting

The inheritance of chloroplast DNA (cpDNA) in sweet potato (Ipomoea batatas Lain.) was analyzed using DNA restriction fingerprinting. The cpDNA fingerprints of hybrids from reciprocal crosses between Xushu18 and AB78-1 were found to be identical to those of their female parents, which reveals that cpDNA of sweet potato is maternally inherited in this intervarietal crossing. This maternal cpDNA transmission pattern does not accord with the putative one based on former cytological studies. The plastid inheritance in Convolvulaceae has been briefly reviewed in this study, and the utility of DNA restriction fingerprinting analysis in the study of plastid inheritance is also discussed.

应用抑制性消减杂交技术克隆PS1TP1的反式激活基因

目的 应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建乙型肝炎病毒（HBV）前-S1蛋白（preS1）反式激活蛋白1（PS1TP1）的相关基因cDNA消减文库,克隆PS1TP1反式激活相关基因,以期发现PS1TP1蛋白反式激活作用的靶位点.方法 以PS1TP1表达质粒PcDNA3.1（-）-PS1TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1（-）为对照;提取mRNA并逆转录为cDNA,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库.结果 文库扩增后得到90个阳性克隆,随机挑选43个克隆测序,并进行同源性分析,获得12种编码基因,其中10个为已知功能基因,另外2个为未知功能序列.结论 成功构建PS1TP1反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.为进一步研究PS1TP1蛋白的功能及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.

乙型肝炎病毒X蛋白基因型特异性功能差异

目的研究B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)功能差异。方法B、C基因型乙型肝炎病毒X基因真核表达载体(分别为pcDNA3.1-XB及pcDNA3.1-XC)及空白载体pcDNA3.1/Hygro(-)以脂质体2000分别转染Chang细胞,转染细胞2d后以流式细胞仪检测凋亡率;转染细胞以潮霉素筛选,14d后形成的抗性细胞集落以冷甲醇固定、Gi msa染色并计数;各载体与指示载体pCMVβ共转染细胞,转染2d后裂解细胞并检测胞内β-半乳糖苷酶的活性。所有数据均以配对t检验进行分析。结果各载体转染Chang细胞后细胞的凋亡率为pcDNA3.1-XC>pcDNA3.1-XB>pcDNA3.1/Hygro(-),形成的抗潮霉素细胞集落数为pcDNA3.1/Hygro(-)>pcDNA3.1-XB>pcDNA3.1-XC,细胞内β-半乳糖苷酶活性为pcDNA3.1-XB+pCMVβ>pcDNA3.1-XC+pCMVβ>pcDNA3.1/Hygro(-)+pCMVβ。结论B基因型HBx反式激活能力高于C基因型HBx,而抗细胞增殖及致细胞凋亡能力都低于C基因型HBx,HBx这些功能差异可能与B、C基因型乙型肝炎病毒致病性差异有关。

STAT蛋白参与树突状细胞中IDO转录调控的研究进展

吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）被认为是一种重要的内源性免疫抑制酶。研究证实IDO在肿瘤的发生发展中扮演十分重要的角色，肿瘤细胞不仅自身能表达IDO，而且还吸引树突状细胞（DC）表达IDO，参与肿瘤免疫耐受的形成。信号转导子与转录激活子家族（STAT）是参与树突状细胞中IDO转录调控的主要信号蛋白家族，详细阐明DC中STAT蛋白对IDO表达的调控机制对于肿瘤治疗很有必要，将会帮助我们开发特异性更强、活性更高的IDO特异性抑制剂，并为抗肿瘤靶向治疗提供新的选择。

TAT-HBX-EGFP融合蛋白的表达、纯化及在小鼠肝脏内的跨膜分布

目的高效表达TAT—HBX—EGFP融合蛋白，研究其在小鼠肝脏内的分布。方法构建TAT-HBX—EGFP重组载体，IPTG诱导使其在BL21中大量表达；蛋白经Ni柱纯化后注射入小鼠体内，免疫荧光观察TAT，HBX—EGFP融合蛋白在小鼠肝脏的分布。结果TAT，HBX—EGFP在大肠埃希菌中获得高效表达；HBX蛋白可以在TAT的引导下进入小鼠肝脏。结论TAT引导肽可以将HBX蛋白引导至小鼠肝脏。