反相斑点杂交法对解脲脲原体分型的研究

目的研究以聚合酶链反应为基础的快速检测与鉴定解脲脲原体基因型的方法。方法选择2003年11月至2005年11月在中山大学附属第二医院门诊就诊的有外阴阴道炎症状和体征的患者601例,设为病例组,同期无自觉症状的正常体检人群306例,设为对照组,分别取宫颈分泌物待检测。将解脲脲原体不同基因型的特异探针固定在硝酸纤维素膜上,临床标本按常规方法提取解脲脲原体DNA,采用生物素标记的解脲脲原体特异通用引物PCR扩增DNA,然后分别与解脲脲原体不同基因型特异探针杂交、显色。结果病例组解脲脲原体阳性421例占70.0%,对照组解脲脲原体阳性126例占41.2%。病例组中单型别感染的U.parvum占65.4%,其中1型、3型、6型和14型分别占28.8%、43.3%、26.0%和1.9%,U.urealyticum占18.4%;对照组中单型别感染的U.parvum占79.3%,其中1型、3型、6型和14型分别占63.2%、21.1%、15.7%和0.0%,U.urealyticum占13.8%。18例阳性标本随机DNA测序鉴定,均为相应的解脲脲原体基因型。结论U.parvum群,尤其是其中的1、3、6型别是正常人群携带的可能性较大,U.urealyticum则有可能和1型起协同作用或独自导致疾病。用反相斑点杂交进行解脲脲原体基因分型,方法简单、实用,适用于临床。

反相斑点杂交快速诊断解脲脲原体基因型及其临床意义

目的:建立1个能用于临床标本直接分型的简单、实用、可靠性好的解脲脲原体基因分型方法;揭示正常携带状态及感染状态下解脲脲原体的基因型。方法:设计分型引物,用反相斑点杂交进行解脲脲原体基因型鉴定。结果:病例组与对照组解脲脲原体基因型的检出率差异无统计学意义,总检出率为89.1%。对照组中解脲脲原体以parvum群(微小脲原体)为主(79.3%),其检出率较女性下生殖道感染患者高(P=0.018),而且以其中的1、3、6基因型的单型别为主(82.6%)。病例组解脲脲原体中两群感染(16.2%)较对照组高(6.9%),差异有统计学意义(P=0.033),其中以T960群与1型的多型别感染在病例组较对照组高(P=0.009);在多型别感染中1型的检出率病例组较对照组高(P=0.026),而单型别感染中1型的检出率在对照组高(P=0.000)。结论:反相斑点杂交能进行解脲脲原体基因分型,方法简单、实用,有望发展成为用于临床标本的解脲脲原体分型的1种方法。Parvum群(微小脲原体),尤其是其中的1、3、6的单型别是正常人群携带的可能性较大。女性下生殖道感染患者解脲脲原体的两群感染较正常体检人群高,尤以T960群与parvum群中1型的多型别感染较正常体检人群高,提示T960群有可能和1型起协同作用或独自导致疾病。

反相斑点杂交快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的建立以聚合酶链反应(PCR)为基础的寡核甘酸探针反相斑点杂交方法快速检测对利福平耐药的结核菌相关的rpoB基因突变，并评价其临床应用价值。方法应用PCR-反相斑点杂交方法对利福平耐药的62株结核菌和对其敏感的40株结核菌进行检测，所得结果与传统药敏试验结果以及102株结核菌的直接测序结果进行比较。结果62株对利福平耐药的菌株中，54株碱基突变被准确鉴定，灵敏度为87．1％(54／62)，阳性预测值为100％；40株对利福平敏感的菌株均被准确鉴定，特异性为100％，阴性预测值为83．3％(40／48)；准确度为92．2％(94／102)。与测序法结果符合率为99％。结论以PCR为基础的反相斑点杂交方法其敏感度和特异性均高，无假阳性结果，因此适用于大批量结核菌对利福平耐药性的初筛。

反相斑点杂交快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的建立以聚合酶链反应(PCR)为基础的寡核甘酸探针反相斑点杂交方法快速检测对利福平耐药的结核菌相关的rpoB基因突变,并评价其临床应用价值。方法应用PCR反相斑点杂交方法对利福平耐药的62株结核菌和对其敏感的40株结核菌进行检测,所得结果与传统药敏试验结果以及102株结核菌的直接测序结果进行比较。结果62株对利福平耐药的菌株中,54株碱基突变被准确鉴定,灵敏度为87.1%(54/62),阳性预测值为100%;40株对利福平敏感的菌株均被准确鉴定,特异性为100%,阴性预测值为83.3%(40/48);准确度为92.2%(94/102)。与测序法结果符合率为99%。结论以PCR为基础的反相斑点杂交方法其敏感度和特异性均高,无假阳性结果,因此适用于大批量结核菌对利福平耐药性的初筛。

女性下生殖道解脲脲原体的基因分型与致病性研究

目的运用反相斑点杂交技术进行解脲脲原体(UU)基因分型,揭示正常携带状态及感染状态下解脲脲原体的基因型,并建立一个能用于临床标本直接分型的简单、实用、可靠性好的解脲脲原体基因分型方法。方法对有阴道炎症状和体征的病例组和正常体检人群进行病史询问、临床检查,先取阴道分泌物,采用FQ-PCR做解脲脲原体检测。设计分型引物,对FQ-PCR阳性标本用反相斑点杂交进行解脲脲原体基因型鉴定。结果病例组与对照组解脲脲原体基因型的检出率差异无显著性,总检出率为89.1%。对照组中解脲脲原体以parvum群(微小脲原体)为主(79.3%),其检出率较女性下生殖道感染患者高(P=0.018),而且以其中的1,3,6基因型的单型别为主(82.6%)。病例组解脲脲原体两群感染(16.2%)较对照组高(6.9%),差异有显著性(P=0.033),其中以T960群与Parvum群1型的多型别感染较高(P=0.009);在多型别感染中1型的检出率病例组较对照组高(P=0.026),而单型别感染中1型的检出率在对照组高(P=0.000)。结论parvum群,尤其是1,3,6的单型别在正常人群携带的可能性较大。而女性下生殖道感染患者解脲脲原体的两群感染较正常体检人群高,尤以T960群与parvum群中1型的多型别感染较正常体检人群高,提示T960群有可能和1型起协同作用或独自导致疾病。

结核分枝杆菌北京基因型菌株rpoB基因突变特征研究

目的分析结核分枝杆菌临床分离株北京基因型的rpoB基因突变特点。方法同时采用IS6110-限制性片段长度多态性(IS6110-RFLP),间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)方法对102株结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,确定北京基因型。采用反相斑点杂交方法检测ropB基因突变。结果 73.5%(75/102)的临床分离株是北京基因型,62株(60.8%,62/102)利福平耐药株中有52株(83.9%,52/62)为北京基因型,10株为非北京基因型;40株利福平敏感株中北京基因型23株,非北京基因型17株。47株北京基因型和7株非北京基因型存在ropB基因突变,最普遍的点突变发生在526位点。结论尽管北京基因型与非北京基因型在ropB基因突变特征上无显著性差别,但北京基因型菌株利福平耐药率和rpoB基因突变率显著高于非北京基因型菌株;以PCR为基础的反相斑点杂交方法具有较高的敏感度和特异度,适用于大批量结核分枝杆菌利福平耐药性的初筛。

HLA-DQA反相杂交法分型与多聚酶链反应－单链构象多态性配型的比较

为了验证多聚酶链反应－单链构象多态性方法在骨髓移植配型中的可靠性和准确性，采用掺入生物素的多聚酶链反应对ＨＬＡ－ＤＱＡ位点基因进行了特异性扩增。将所选区分ＨＬＡ－ＤＱＡ位点等位基因的特异性探针点于尼龙膜上，用标记的扩增产物与膜上探针杂交，并用碱性磷酸酶显色法检测杂交信号，确定待测标本的基因型。对２０对异基因骨髓移植的供、受者进行ＨＬＡ－ＤＱＡ位点的基因分型，并与多聚酶链反应－单链构象多态性配型作比较。结果表明，２０对供、受者的多聚酶链反应－单链构象多态性配型结果与该反相杂交法基因分型结果一致。多聚酶链反应－单链构象多态性方法是一种骨髓移植的供、受者配型。

结核分枝杆菌北京基因型菌株rpoB基因突变特征研究

目的分析结核分枝杆菌临床分离株北京基因型的rpoB基因突变特点。方法同时采用IS6110-限制性片段长度多态性（1S6110-RFLP），间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）方法对102株结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型，确定北京基因型。采用反相斑点杂交方法检测rpoB基因突变。结果735％（75／102）的临床分离株是北京基因型，62株（60．8％，62／102）利福平耐药株中有52株（83．9％，52／62）为北京基因型，10株为非北京基因型：40株利福平敏感株中北京基因型23株，非北京基因型17株。47株北京基因型和7株非北京基因型存在rpoB基因突变，最普遍的点突变发生在526位点。结论尽管北京基因型与非北京基因型在rpoB基因突变特征上无显著性差别，但北京基因型菌株利福平耐药率和rpoB基因突变率显著高于非北京基因型菌株；以PCR为基础的反相斑点杂交方法具有较高的敏感度和特异度，适用于大批量结核分枝杆菌利福平耐药性的初筛。

解脲脲支原体基因型的检测及其意义

目的了解解脲脲支原体(Uu)基因分型情况,探讨其基因分型临床意义。方法选择2010年8月-2011年2月在绍兴县中心医院门诊380例女性生殖道感染患者,以及同期无自觉症状的240例健康体检者,分别收集宫颈拭子标本,运用荧光定量PCR技术(RT-PCR)筛选出Uu阳性的初诊样本,设计分型引物,运用反向点杂交技术进行基因分型检测。结果患者组Uu阳性270例,阳性率为71.05%,健康组阳性104例,阳性率为43.33%;患者组单纯U.parvum群感染率为63.77%,低于健康组的78.79%,差异有统计学意义(P<0.05);健康组中解脲脲支原体parvum群以其中的1、3、6基因型的单型别为主;患者组中Uu两群感染率较健康组高,差异有统计学意义(P<0.05);患者组U.urealyticum群与1型的多型别感染率高于健康组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 U.parvum群,尤其是其中的1、3、6型别是正常人群携带的可能性较大,U.urealyticum则有可能和1型起协同作用或独自导致疾病。