鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因组全序列,选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4进行复合套式PCR,建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段,与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT-nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明,有15份类似CDV强毒,5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT-nPCR可以有效检测CDV感染,能够将强、弱毒株区分开,可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。

套式反转录PCR检测水中肠道病毒

依据文献报道的多种肠道病毒的核酸序列，设计合成了可用于多种肠道病毒检测的肠道病毒通用引物（外侧引物），以及可同时检测脊髓灰质炎（简称脊灰）病毒（Ⅰ～Ⅲ型）的特异性引物（内侧引物）。将两者结合起来可进行脊灰病毒的套式ＰＣＲ检验，既可检测多种肠道病毒，又可区分测定出脊灰病毒。此外对实验方法进行了改进，使操作方法更趋简单，中间可能污染的环节较少，结果稳定。与常规反转录ＰＣＲ比特异性强、敏感性高（可检测出只含１个ｐｆｕ病毒的水样）。

新型反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗方法的建立

对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计1对通用引物,扩增片段为609bp,并在该对引物扩增区域内设计针对疫苗弱毒的特异引物,扩增片段为237bp,建立一种能够区分猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的敏感、特异、重复性好的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别诊断方法。该方法能将我国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来,且不与牛病毒性腹泻病毒及其他猪源病毒发生非特异反应。应用本试验建立的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法可以及早对猪瘟作出准确诊断,并可将强毒感染猪迅速从弱毒疫苗免疫猪群中筛选出来,减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。

套式逆转录PCR检测戊型肝炎病毒RNA的临床应用

目的评价套式逆转录PCR检测血清戊肝病毒(HEV)RNA的临床意义。方法对GenBank数据库中的戊型肝炎病毒全基因组序列进行分析比对,并针对国内流行的HEV株序列,选择位于ORF2的保守区域设计引物,建立套式逆转录聚合酶链式反应(nRT-PCR)方法,并检测126例急性戊型肝炎患者,并与检测抗-HEV IgM的方法进行比较。结果 126例急性戊型肝炎患者血清中有67例HEV-RNA阳性,对照组血清HEV-RNA检测均为阴性;与血清抗-HEV IgM检测结果比较,HEV-RNA检测的总符合率为80.91%,两种方法的检测结果具有良好的一致性;nRT-PCR方法检测HEV-RNA与血清抗-HEV IgM检测方法存在明显的差异,不能相互替代,而有一定的互补性;3例患者的首份血清检测为HEV-RNA阳性,但抗-HEV IgM为阴性,系列追踪检测,均相继出现抗-HEV IgM,急性戊型肝炎患者血清HEV-RNA的检出多在发病的1～12d。结论应用nRT-PCR方法能对急性散发戊型肝炎患者血清中的HEV RNA进行定性检测,且有较高的特异性和敏感性,临床使用可以提高对HEV早期诊断的水平,具有一定的临床应用价值。

猪瘟病毒3种检测方法的比较

本研究旨在比较3种检测猪瘟病毒方法的优缺点。应用反转录—复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)、荧光抗体法、胶体金免疫层析试纸条3种方法,分别对30份疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒进行检测。试验结果显示,RT-nPCR方法检出阳性样品数为11份,荧光抗体法为13份,胶体金免疫层析试纸条为8份;3种方法检测全为阳性8份,全为阴性17份。试验结果表明,荧光抗体检测法所需时间较短,但需要经验比较丰富人员来判定结果,且存在假阳性结果,敏感性比较差;胶体金免疫层析试纸条诊断方法最大的优点就是简便快速,且适合基层的应用,该方法的不足之处就是敏感性较低;RT-nPCR检测法具有快速、敏感等优点,但需一定仪器设备及成熟的技术方法。RT-nPCR还能区分待检样品为疫苗毒株(弱毒)还是野毒株感染(强毒),这是其他2种方法所不可比拟的。

癌胚抗原信使核糖核酸在不同类型肺癌组织中的表达

目的 比较不同类型肺癌组织表达癌胚抗原信使核糖核酸 (CEAmRNA)的差别 ,评估检测组织标本CEAmRNA指标在诊断与鉴别诊断肺癌方面的应用价值。方法 选取肺癌组织为研究对象 ,非癌性疾病的肺病变组织为对照 ,应用反转录套式聚合酶链反应 (RT NP PCR)技术检测CEAmRNA。结果 肺癌组总体表达CEAmRNA的阳性结果为 6 6 / 76 (86 .8% ) ,其中 ,不同类型肺癌组织表达CEAmRNA的阳性结果分别为 :腺癌 2 2 / 2 5 (88.0 % )、鳞癌 19/ 2 2 (90 .5 % )、腺鳞癌 8/ 8(10 0 % )、小细胞癌 10 / 12 (83.3% )、大细胞未分化癌 7/ 9(77.8% )。对照组织有 2例阳性发现 (8.0 % )。结论 各类肺癌组织表达CEAmR NA的结果明显高于非肺癌组织 (P <0 .0 0 1) ,检测肺组织标本CEAmRNA指标对诊断肺癌具有较高的应用价值 (特异性为92 .0 %、敏感性为 86 .8% )。

猪瘟疫苗毒株和流行毒株RT-nPCR检测方法的建立

为给临床快速鉴别诊断猪瘟提供技术依据,根据GenBank公布的CSFV全基因序列,结合猪瘟序列测定结果,针对NS5B基因区域设计2条通用外扩引物、2条通用内扩引物和1条疫苗毒株特异性内扩引物,建立一种可鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株的RT-nPCR诊断方法。结果显示,该方法可从HCLV株扩增出2条大小分别为261bp和157bp的片段,可从Shimen、SXYL2006、GX54和SD2002等流行毒株扩增出1条261bp的片段,其他几种常见猪病毒检测均呈阴性;灵敏度试验表明,检测的cDNA质量浓度极限为3.4×10-7 pg/L;116份临床样品中有37份样品检测呈阳性,阳性率为32%;分析部分阳性病料E2基因序列也证实检测结果的准确性。说明:建立的RT-nPCR鉴别诊断方法灵敏度高、特异性好,能直观区分猪瘟疫苗毒株和流行毒株。

广西牛群戊型肝炎病毒感染情况调查

为了解广西牛群中戊型肝炎(HE)的感染状况,应用反转录—套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)对采自广西8个市牛群的粪、肝样品进行了戊型肝炎病毒(HEV)RNA检测。结果从广西6个市牛粪样品中检出HEV阳性率为19.13%(35/183),从4个市牛肝样品中检出HEV的阳性率为20%(5/25),8个市牛粪、牛肝样品中HEV的总阳性率为19.23%(40/208)。表明广西受检牛群中存在HEV感染,应重视牛HE这一新发人畜共患传染病的防控。

禽传染性支气管炎病毒纤突蛋白S_1基因的RFLP与序列比较分析

利用反转录一套式聚合酶链式反应技术从北京地区禽传染性支气管炎病毒(IBV)分离株 BJ_1、BJ_2、BJ_3株中成功扩增出1054bp 纤突蛋白高变区。利用限制性内切酶 Sin Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切分析证实了RT-nested PCR 的特异性,结合计算机酶切位点分析图谱进行理论 RFLP 分析。将三段 S_1基因分别克隆到pUC19质粒中,获得重组质粒 pUC IBV S_1-BJ_1、pUC IBV S_1-BJ_2、pUC IBV S_1-BJ_3。利用双脱氧链终止法对三个重组质粒进行双向测序,获得三株分离株 S_1基因高变区的序列。将得到的三个序列与标准株 M_(41),Beaudette 株和疫苗株 H_(120)及广东地方分离株 D_(41)株进行核酸序列同源性比较分析。结果表明,三株分离株核酸碱基序列和氨基酸序列与 M_(41)株的同源性比与 H_(120)株和 Beandette 株的同源性高。本研究对于进一步深入探讨禽传染性支气管炎病毒(IBV)分子变异机制研究奠定了良好的基础。

五种中草药感染和传播葡萄重要病毒风险评估试验

为评估牛膝、紫苑等5种中草药感染和传播国内葡萄重要病毒的风险,试验以GFLV等10种葡萄病毒为毒源,将牛膝、紫苑等5种备选植物与葡萄毒源同盆栽植进行自然接种,同时采用人工摩擦接种,对两种接种方法处理的中草药分别进行RT-PCR检测。RT-PCR检测结果显示,所有检测样品均无目的条带,不带所检病毒。通过以上试验结果表明,10种葡萄病毒未传播到5种中草药植株上。葡萄园中套种紫苑、牛膝、罗勒、紫苏和决明子5种中草药没有侵染和传播国内重要葡萄病毒的风险。

检测组织标本癌胚抗原信使核糖核酸指标诊断胃癌

目的 :评估检测组织标本癌胚抗原信使核糖核酸 (CEA- m RNA)指标在诊断胃癌方面的应用价值。方法 :以胃癌组织和良性胃病组织为检测标本 ,应用反转录套式聚合酶链反应技术 (RT- NP- PCR)检测 CEA- m RNA。结果 :CEA- m RNA的检出率在 32份胃癌标本为 81 .2 % (2 6 /32 )、在 32份良性胃病标本为 1 2 .5 % (4 /32 ) ,两者检测结果的差别具有显著性 (P<0 .0 0 1 )。结论 :检测组织标本 CEA- m

5匹马外周血单个核细胞表达MHC-I类分子的差异分析

基于RT-PCR方法，扩增了用于马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus，EIAV）减毒疫苗株CTL表位研究的5匹马的编码经典MHC—I类分子的大部分基因，具体包括编码肽结合区大部分区域、α3区、穿膜区及胞浆区蛋白的基因，并进行了PCR产物的克隆和测序。试验马匹外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的总RNA提取物经RT-PCR扩增，并将所得产物进行T-A克隆。从每匹马的所有克隆中，分别随机挑取鉴定为阳性重组质粒的21～23个克隆用于测序分析。研究结果表明，5匹试验马匹各自具有3～5个等位基因，由于MHC-Ⅰ分子等位基因表达的共显性特征，可以推测马的基因组内可能存在2～3个基因座对应于这些等位基因，这与国外已有研究结论基本一致。另外，不同马匹PBMC表达的MHC-Ⅰ类分子的差别水平不一致。除了6号与7号和10号马之间MHC-Ⅰ类分子的差异较大，无相同或高度相近的经典MHC-Ⅰ类分子序列外，各马匹间均表达具有1个或1个以上的相同或高度同源的对应经典的MHC-Ⅰ类分子的mRNA。以上研究结果既可作为正在开展的EIAV减毒疫苗株CTL表位研究的基础性、支持性数据，又可进一步丰富国内马的经典MHC-Ⅰ分子多态性方面的相关研究。

河南省牛病毒性腹泻病毒分子流行病学调查与分析

为了解河南地区规模化奶牛场牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)的感染情况及主要基因型,用商品化酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对来自河南省14个市和不同地区的40个规模化奶牛养殖场共5 486份血清中BVDV抗原进行检测,同时对ELISA方法检测的97份抗原阳性样本,用套式逆转录-聚合酶链式反应(nRT-PCR)进行BVDV抗原检测和基因分型。结果表明,A10奶牛场BVDV抗原阳性率最高,为7.8%(11/141),A11、A17奶牛场BVDV抗原阳性率最低,为0.66%(1/151)。不同牛场的BVDV抗原阳性率为0~7.8%,平均阳性率为1.77%;河南地区牛病毒性腹泻病毒的基因型均为BVDV-1型,未发现其他基因型。提示BVDV在河南省规模化奶牛场存在,但不同地区、不同牛场的BVDV阳性率不同,主要以BVDV-1型感染为主。

家畜戊型肝炎病毒诊断方法的建立及应用

目的建立检测家畜戊型肝炎病毒(HEV)反转录套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法,并应用于广西地区家畜戊型肝炎感染调查。方法参考GenBank上4种基因型HEV核苷酸序列,应用生物软件Oligo6.0在ORF2保守区设计两对简并引物,扩增目的片段为436bp,进行了特异性、敏感性和重复性试验,并对采自广西地区猪、牛和羊的肝粪样本进行HEV检测。结果检测家畜粪便样本阳性率31.49%(285/905);家畜肝脏样本阳性率18.01%(49/272)。结论所建立的RT-nPCR方法适用于家畜肝粪样本HEV检测,临床检测应用表明广西家畜存在HEV感染。

A群轮状病毒一步法RT-ddPCR方法的建立

目的:建立A群轮状病毒(rotavirus,RV)一步法反转录微滴式数字聚合酶链式反应(reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)方法。方法:筛选特异性引物探针,建立并优化一步法RT-ddPCR方法,确定特异性;制备含A群RV目的片段的RNA标准物质,确定建立方法的检测限、准确度、重复性和复现性。A群RV阳性粪便样品梯度稀释后制作染毒液,制备人工染毒样品,分离病毒与食品基质,浓缩得到病毒悬液,提取RNA后,比较不同食品基质中一步法RT-ddPCR检测结果。结果:建立的一步法RT-ddPCR方法定量限为58000.00~5.80拷贝/μL,具有良好的特异性、准确性、灵敏度、重复性和复现性。各染毒水平下A群RV检出量和回收率在不同食品基质中存在显著性差异(P<0.05)。结论:研究建立的一步法RT-ddPCR方法可准确定量A群RV RNA,食品基质可影响一步法RT-ddPCR检测结果,通过病毒回收率可计算食品中A群RV的实际载量。

两种不同基因型NS3抗原在HCV感染者血清学诊断中的应用

目的研究两种不同基因型NS3抗原在HCV感染者血清学诊断中的应用价值。方法分别用两种不同基因型NS3单片段抗原、两种单片段抗原的混合物(MIX)作为包被抗原,对血清标本进行ELISA测定;应用反转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)检测血清中HCV RNA,数据以χ2检验。结果 85份抗-HCV阳性血清以不同基因型HCV NS3单片段抗原检测,阳性检出分别为52份(Ⅰ型)和50份(Ⅵ型),χ2=0.06,P>0.05;100份健康成人体检血清以此两种抗原检测均为阴性;90份抗-HCV阳性血清经MIX抗原检测,阳性检出为65份;51份抗-HCV阳性血清经RT-nPCR检测,29份阳性。结论 HCV不同基因型NS3编码区抗原片段有不同的抗原反应性,在HCV感染者的血清学诊断中将不同基因型NS3抗原混合使用可能是更好的选择。

新疆奶牛戊型肝炎病毒RNA检测及序列分析

从新疆两个奶牛场的戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）抗体检测阳性的奶牛中分别采集牛粪便或肛拭子样品,利用反转录套式聚合酶链反应（RT-nPCR）检测所采集样品中的HEV RNA,结果来自第一个奶牛场的7份牛粪便样品为阳性,阳性率11.67%,来自第二奶牛场的1份肛拭子样品为阳性,阳性率为3.23%。将PCR扩增产物克隆、测序并进行序列分析,结果表明,对应于HEV ORF2 189bp核苷酸序列的8个牛源HEV基因组扩增片段的同源性为96.3%-100.0%,应当属于相同的基因型; 它们与HEV 1、2、3和4型ORF2 189bp核苷酸平均同源性分别为78.5%-86.4%,81.7%-83.8%,79.1%-85.3%和84.3%-95.8%,与4型的同源性最高达93.2%-95.8%。基于这些已测序核酸片段绘制的基因进化树显示：本研究中的8株牛源HEV ORF2 189bp核苷酸序列与HEV 4型人源C5株、猪源swC3与swXJ株位于同一进化枝上,同属HEV基因4型,提示新疆奶牛中可能存在HEV感染,并且奶牛可能是人类HEV传染源中除猪之外的新宿主。