鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因组全序列,选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4进行复合套式PCR,建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段,与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT-nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明,有15份类似CDV强毒,5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT-nPCR可以有效检测CDV感染,能够将强、弱毒株区分开,可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。

逆转录多重套式聚合酶链反应在儿童病毒性脑炎病原学研究中的应用

目的探讨早期同步检测病毒性脑炎(VE)主要病原新方法.方法应用逆转录多重套式聚合酶链反应(RT-M-nPCR)对100例VE患儿及73例对照组脑脊液(CSF)标本进行单纯疱疹病毒(HSV)DNA与肠道病毒(EV)RNA同步检测.结果整个过程约需5 h.该法与ELISA及经典nPCR方法比较,符合率分别为96%及100%.100例VE患儿CSF标本中,HSV阳性18例,EV阳性17例,在100例VE中,有26例重症,其中HSV感染14例(53.85%),EV感染7例(26.92%),不明病原5例(19.23%).不同病原检出率与年龄的关系:年龄～3岁、～7岁、～14岁HSV分别检出7.4%、11.9%、35.5%,EV分别检出25.9%、19.05%、6.5%.结论RT-M-nPCR是一种能在早期同步检测HSV及EV的具有巨大潜在应用价值的病原检测技术;在VE重症中HSV感染最常见;HSV感染在年长儿发病率高,而EV感染在学龄前及婴幼儿中多见.

应用反转录聚合酶链式反应快速检测蕃茄环斑病毒

应用反转录聚合酶链式反应快速检测蕃茄环斑病毒陈京，胡伟贞，于嘉林，韩成贵关键词反转录聚合酶链式反应，蕃茄环斑病毒近年来发展起来的分子生物学新技术一聚合酶链式反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）已在检测和分子生物学研究等许多领...

反转录酶在微小RNA实时荧光定量聚合酶链反应中的作用

目的以微小RNA(miRNA)作为检测样本,考察影响实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结果的关键点,并筛选出最优的检测方法。方法采用3种miRNA提取方法(分别使用EasyPure^(■)miRNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒、TransZol Up Plus RNA提取试剂盒)和3种反转录方法(分别使用TransScript^(■)第一链cDNA反转录试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、miRNA第一链cDNA合成试剂盒)处理大鼠纹状体脑区,检测miRNA与c DNA的质量和效率,并使用常规RT-qPCR检测miRNA水平,比较不同方法所得结果。结果3种RNA提取方法得到的miRNA质量和效率比较差异均有统计学意义,其中方法2的效果较好,但方法1、2、3的RT-qPCR结果比较差异无统计学意义(miR-132:25.91±9.79、25.26±10.25、27.28±7.39,miR-U6:27.98±11.25、25.98±9.78、29.62±9.65,均P>0.05);3种反转录方法所得实验结果比较差异有统计学意义,方法3所得结果明显低于方法1、方法2(miR-132:16.53±3.17比35.20±1.06、31.42±2.95,miR-U6:16.63±1.73比36.06±2.57、35.59±1.54,均P<0.05),主要影响RT-qPCR的扩增效率和扩增特异性。结论使用能高效富集约18 nt大小RNA的提取方法和在miRNA的3’末端加多聚A尾(Poly A)的反转录酶,可以得到更可靠的RT-qPCR结果。

半套式聚合酶链反应检测牛奶中部分肠道致病菌

目的 建立一套食物中的单核细胞增生性李斯特氏菌、耶尔森氏菌和副溶血性弧菌等肠道致病菌的快速检测方法。方法 采用裂解法提取DNA与各自的三条引物进行二次聚合酶链反应扩增(简称半套式PCR),检测模拟阳性牛奶中部分肠道致病菌。结果 常规PCR能检出100个活菌的存在,在其产物进行半套式PCR检测时有10个活菌存在时即可扩增出特异性产物,提高10倍。最低检测限可达10 cfu(集落形成单位)。结论 本方法具有特异性强、敏感性高、简便快速等特点。

套式聚合酶链反应检测各孕期孕妇巨细胞病毒感染

目的评价套式聚合酶链反应（ＮＴ－ＰＣＲ）加限制酶切分析在各孕期人类巨细胞病毒（ｈＣＭＶ）感染检测中的应用。方法ｈＣＭＶ检测采用病毒分离、血清学试验、ＮＴ－ＰＣＲ加限制内切酶谱分析。结果３６７例孕妇中孕早、中、晚期ｈＣＭＶ阳性检出率分别为８．６％、１．６％及７．０％。经ＮＴ－ＰＣＲ检测，１８例ｈＣＭＶＤＮＡ阳性，阳性率为４．９％，而病毒分离，特异性ＩｇＭ及ＩｇＡ阳性率分别为３．０％、１．１％及２．２％。ＮＴ－ＰＣＲ阳性检出率高于病毒分离等其它方法（Ｐ＜０．０２５），与ＰＣＲ法比较，病毒分离特异性为１００％，敏感性为６１．１％，近３０％ｈＣＭＶ感染的孕妇ＰＣＲＤＮＡ阳性，表现为ＤＮＡ血症。结论ＮＴ－ＰＣＲ能早期检出孕妇ｈＣＭＶＤＮＡ，对孕妇ｈＣＭＶ感染的监控有重要意义。

套式聚合酶链反应在豚鼠巨细胞病毒宫内感染模型中的应用价值

目的 运用套式聚合酶链反应 (N -PCR)检测豚鼠巨细胞病毒 (GPCMV)宫内感染 ,并探讨N -PCR在模型建立中的应用价值。方法 选择无感染史豚鼠 ,受孕后腹腔接种GPCMV ,分娩后 2 4h内处死 ;观察妊娠结局 ,运用N -PCR检测亲代及子代感染情况 ,并对标本进行病理学检查。N -PCR的特异性实验设阴性、空白和阳性对照。结果 感染孕鼠出现病毒血症征象 ,胎仔出现流产、死胎等异常结局。N -PCR检测显示 ,亲代 10 0 % ( 10 / 10 )感染 ,子代 96 .0 % ( 2 4 / 2 5 )感染 ,且感染脏器均出现非特异性组织病理学变化。N -PCR有较高的GPCMV检测特异性和灵敏性。结论 N -PCR检测GPCMV宫内感染 ,简便、快速、灵敏、准确 。

应用套式聚合酶链反应技术分析细菌与胆固醇结石形成关系的初步研究

目的 :旨在从分子水平研究细菌感染与胆固醇结石形成之间的关系 ,以期阐明胆固醇结石发病的分子机理和探讨可能防治的新途径。 方法 :从 36例胆汁细菌培养阴性的胆囊胆固醇结石中提取 DNA,应用套式聚合酶链反应 ( NP- PCR)技术 ,从中特异性地扩增细菌 DNA片段。 结果 :发现 30例 ( 83.33% )胆固醇结石中有细菌 DNA存在。其中胆固醇含量在 30 %～ 69%之间 6例 ( 6/ 6) ;70 %～ 90 %之间 14例 ( 14/ 17) ;>90 % 10例 ( 10 / 13) ,尚未发现结石中胆固醇和水分含量多少与细菌 DNA存在与否有关。采用 16S r RNA基因序列对照分析鉴定细菌种类 ,在 10例( 2 7.78% )胆石中发现与大肠杆菌相似的 DNA片段 ;从 8例 ( 2 2 .2 2 % )胆石中得到痤疮丙酸杆菌型 DNA序列 ;2例 ( 5.56% )胆石中残留的细菌 DNA片段与化脓性链球菌相关 ;8例 ( 2 2 .2 2 % )胆石内细菌的 DNA片段具有多样性 ,类似于大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌、化脓性链球菌、艰难梭状芽胞杆菌或其它未鉴定细菌 ,可能有多种细菌混合感染。另有 2例胆石的细菌 DNA分子量较低 ,不同于大肠菌、痤疮丙酸杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌和铜绿色假单胞菌 ,归类于其它未鉴定细菌。 结论 :证实多数胆固醇结石内有细菌 DNA存在。至于这些微生物在胆固醇结石形?

套式聚合酶链反应法检测外周血单个核细胞中HBcVccDNA

目的:建立套式聚合酶链反应法(nPCR)检测慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)。方法:根据HBV基因组DNA正负链上下游缺口序列,设计两套相对保守的引物,建立HBV cccDNA套式PCR,并用该法检测200例慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA。结果:该法检测200例慢性乙型肝炎患者,HBV cccDNA阳性率为60%。结论:套式PCR法简便、灵敏,可用于测定PBMC中HBV cccDNA。

套式聚合酶链反应直接测序法分析产超广谱β-内酰胺酶菌TEM全基因

目的 建立套式聚合酶链反应直接测序方法分析产超广谱 β 内酰胺酶菌TEM全基因 ,以便TEM分型和发现新的亚型。方法 根据Genbank核酸数据库已登录的TEM各亚型序列 ,在保守区自行设计 4条引物 ,分A、B两段半套式重叠扩增TEM全基因 ;并对A段作正向测序 ,B段作反向测序。结果 大肠埃希菌TEM 1、TEM 2、TEM2 6等 3种典型菌株均成功扩出A、B两段 ,产物直接测序波峰锐利 ,信噪比值高。该三株菌测得的序列与已在Genbank登录的序列一致。

套式-聚合酶链反应在山东省恙虫病检测中的应用

目的 :利用分子生物学手段对山东省部分地区的人和鼠进行调查 ,了解恙虫病在山东省的感染情况。方法 :采用套式 -聚合酶链反应 (nested- PCR)技术 ,对在山东省 6个市 (县、区 )捕获的野鼠或家鼠的肝、脾、肾组织标本 ,以及临床诊断为恙虫病的病人血标本进行检测。结果 :共检测鼠脏器标本 198份 ,阳性 8份 ,阳性率为 4 .2 4 % ;共检测临床诊断恙虫病病人血标本 14份 ,阳性 7份 ,阳性率为 5 0 %。结论 :首次在山东省黄河以北地区捕获的鼠体内检测到恙虫病东方体 ,其中两只鼠为褐家鼠 。

套式聚合酶链反应在HIV-1检测中的应用

根据HIV-1 gag.pol和env基因序列设计了套式聚合酶链反应(nesled polymerasechain reaction,nPCR)引物。将外周血单个核细胞裂解液先用外侧引物扩增,其产物再经内侧引物扩增,直接走凝胶电泳判定结果。nPCR的敏感性。较常规PCR高100～1000倍,可检测到0.5fg质粒DNA和50μ1HIV-1感染者外周血样中的HIV基因。用本法检测63名HIV-1感染者全为阳性,而61名健康人和可疑者均为阴性,后者经追踪检测抗体排除了HIV-1感染。实验证明,nPCR是一种敏感性极高、特异性很强、操作简便易行的HIV-1基因检测技术。它已经在早期诊断和外周血病毒含量检测中发挥了重要作用,而且有着更广阔的应用前景。

套式聚合酶链反应法检测军团菌

应用套式聚合酶链反应（ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）技术，建立了扩增嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强因子（ｍｉｐ）基因序列的方法。对１４株标准军团菌和５株标准大肠埃希氏菌等进行检测。结果仅嗜肺军团菌扩增出６４９ｂｐ特异性片段，扩增灵敏度为１００ＣＦＵ／ｍｌ。对１７份人血标本进行检测。

聚合酶链反应检测4种猪源细胞系中的内源性反转录病毒(英文)

为了建立检测猪内源性反转录病毒 (porcine endogenous retrovirus,PERV)的特异性方法 ,根据已发表的 PERV的序列 ,设计并合成了针对 PERV核心蛋白 (gag)、多聚酶 (pol)、囊膜蛋白 (env)基因的 3对引物 ,预期扩增片段分别为 36 1、15 0、2 6 5 bp。应用 PCR技术检测了 PERV在 4株猪源细胞中的整合情况。结果表明 ,在所有被检细胞的基因组中均存在有 PERV的前病毒序列 ;应用 RT- PCR检测上述 4株猪源细胞中 PERV特异性 m RNA的表达 ,结果均为阳性。试验还对建立的上述 2种方法的特异性进行了探讨 ,结果表明试验建立的 PERV检测法具有较高的特异性。该方法的建立为进一步研究 PERV奠定了基础 ,还可对异种移植动物模型及异种移植受体进行病原安全性监测。