由反转录病毒载体转移的马立克病毒糖蛋白D基因在感染细胞中的表达

用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ将已分离和克隆的马立克氏病病毒糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因从重组ｐＭｇＤ１８质粒中切出，克隆进反转录病毒质粒载体（ＲＣＡＳ）的连接质粒载体ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ的相同位点。用ＣｌａＩ再将ｇＤ重组ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ中的ｇＤ基因切出，构建于ＲＣＡＳ的ＣｌａＩ位点。通过原位杂交筛选重组ＲＣＡＳ，并结合酶切分析鉴定出ｇＤ插入方向正确的重组ＲＣＡＳ。用磷酸钙沉淀法将ｇＤ重组ＲＣＡＳ转染鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），转染后第９天收集细胞上清，用其感染原代ＣＥＦ，在感染后第４天和第６天收集ＣＥＦ。提取ＣＥＦ基因组ＤＮＡ，用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记ｇＤ基因片段作为探针，通过Ｄｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测基因转移情况。用上述上清再次感染原代ＣＥＦ，在第６天用异硫氰酸胍－氯化铯离心法提取感染细胞总ＲＮＡ，用Ｄｉｇ和３２Ｐ标记ｇＤＤＮＡ为探针，分别用Ｄｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测ＭＤＶｇＤｍＲＮＡ。结果表明，转染的重组ＲＣＡＳ不仅在细胞内成熟为具传染性的完整病毒。