反转录病毒载体RCASBP介导的EGFP基因在DF-1细胞中的表达

为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV)p27抗原的ELISA检测盲传至第4代的细胞上清,ELISA阳性结果说明重组病毒拯救成功;荧光显微镜观察发现80%以上DF-1细胞都有明显的绿色荧光信号,证明DF-1细胞表达绿色荧光蛋白;对DF-1细胞基因组进行特异性PCR检测,扩增出特异性条带说明重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP携带的EGFP基因整合到DF-1细胞的基因组中。本研究建立的RCASBP介导反转录病毒表达体系为研究ALV基因的结构和功能奠定了基础。

人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建

背景:外源性端粒酶反转录酶的表达可重建端粒酶活性,诱导细胞永生化。目的:采用慢病毒载体作为基因转移载体,克隆人端粒酶反转录酶的编码区全序列,同时选用绿色荧光蛋白作为目的基因表达标志物,构建人端粒酶反转录酶慢病毒表达载体。设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2007-06/2008-03在暨南大学生物工程研究所及暨南大学附属第一医院中心实验室完成。材料:pBABE-puro-hTERT质粒由Robert Weinberg教授惠赠,质粒pDONR221,pLenti6/V5-DEST,ccdBSurvival,Stbl3及293FT细胞由暨南大学生物工程研究所提供。方法:以pBABE-puro-hTERT质粒为模板聚合酶链反应法获取目的基因人端粒酶反转录酶(包含酶切位点BglⅡ、HindⅢ),通过BP反应克隆至pDONR221,以质粒pEGFP-N1为模板,以聚合酶链反应法获取目的基因增强型绿色荧光蛋白(包含酶切位点HindⅢ,BgⅢ),通过酶切及连接反应形成pDONR221-hTERT-EGFP。采用LR重组酶将pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP。将pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞。主要观察指标:通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证重组质粒pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP是否构建成功。包装重组慢病毒,应用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白在293FT细胞中的表达情况。结果:测序发现慢病毒入门载体pDONR221包含目的基因hTERT1547位点存在点突变(原碱基A变成G),通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP成功构建。转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。结论:实验成功构建了人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因的慢病毒表达载体,为人端粒酶反转录酶稳定转染提供快速、简洁的方法。

反转录病毒载体介导的EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中的表达

目的构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒载体,并且探讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法使用基因重组技术构建携带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞,计数NIH3T3荧光表达细胞的数量来确定病毒的浓度;使用RV载体感染SK-N-SH细胞,通过流式细胞学荧光检测明确RV在SK-N-SH细胞的感染效率。结果成功构建了基因转移载体RV/EGFP,确定重组病毒的浓度为8.3×106病毒颗粒/mL。在SK-N-SH细胞RV/EGFP稳定转染并有效表达。在SK-N-SH细胞EGFP的荧光表达显示RV的转移并且表达的效率达到30%以上。结论SK-N-SH细胞能被RV病毒载体有效感染,在转基因细胞株外源基因的表达长期稳定并且显示RV病毒载体具有良好的基因转移效率。

人雌激素β受体RNAi反转录病毒载体在人成骨样MG63细胞中的表达

背景:目前已有较多关于雌激素α受体基因如何参与骨代谢的研究,而对雌激素β受体基因如何参与骨代谢的研究则相对较少。目的:构建人雌激素β受体RNAi反转录病毒表达载体,并通过病毒介导其在人成骨样MG63细胞中表达。方法:根据GeneBank数据库提供的雌激素β受体基因核苷酸序列,选择设计3条针对人雌激素β受体干扰靶序列,并与pRNAT-H1.4/Retro质粒定向连接,构建真核表达载体pRNAT-H1.4/Retro-雌激素β受体-shRNA,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。将pRNAT-H1.4/Retro-雌激素β受体-shRNA经脂质体转染至293细胞包装成反转录病毒。将包装好的反转录病毒,以空白及非特异性shRNA作为对照,感染人成骨样MG63细胞株。结果与结论:3个连接了雌激素β受体-shRNA的重组质粒经酶切鉴定分析证实目的序列己插入到预计位点,符合设计要求,测序鉴定表明重组质粒中含有针对雌激素β受体基因目的序列,表明重组质粒构建成功。并经脂质体转染至293细胞后成功包装成反转录病毒。反转录病毒载体能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞株,感染效率为70%左右。包装后的3种雌激素β受体-shRNA反转录病毒均能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞,并显著抑制雌激素β受体的表达。其中以雌激素β受体-shRNA3为最佳的干扰序列。

RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)对端粒酶活化起重要作用,但利用构建针对其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形胶质细胞中的表达却少有报道。目的:构建用于RNA干扰的靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体,并观察其对端粒酶反转录酶表达的抑制作用。方法:通过设计合成出shRNA-TERT序列,经聚合酶链反应扩增后定向连接到pLentilox3.7U6载体上构建重组质粒,经转染DH5α细胞筛选阳性菌落后行测序鉴定。将pLentilox3.7U6-TERT重组质粒转染293T细胞,包装产生重组慢病毒Le-TERT并测定其滴度,再用Le-TERT感染大鼠脊髓星形胶质细胞,实时定量-聚合酶链反应检测各细胞株TERT基因表达水平,并利用Western blot和免疫荧光分别检测TERT蛋白的表达。结果与结论:基因测序鉴定证明,pLentilox3.7U6-TERT重组质粒构建成功,并成功包装慢病毒。实时定量PCR、Western blot和免疫荧光检测结果表明,Le-TERT转染星形胶质细胞4 d后,对TERT mRNA的干扰效率可达(63.98±2.6)%,Le-TERT在转然后的星形胶质细胞中呈低表达。结果证实,实验构建的重组表达载体pLentilox3.7U6-TERT能够产生有效滴度的慢病毒,感染大鼠脊髓星形胶质细胞后,该载体可以有效抑制TERT的表达。

牛Klf4基因重组反转录病毒载体的构建及产毒细胞株的建立

为了克隆牛Klf4基因并构建重组反转录病毒载体,得到稳定的产毒细胞株,本研究设计了带有酶切位点的一对引物,以接触抑制生长状态的MDBK细胞为材料,用RT-PCR方法克隆出牛Klf4基因的开放阅读框序列,将之插入干细胞反转录病毒载体pMSCVneo构成真核表达载体pMSCV-Klf4;采用脂质体法将pMSCV-Klf4转染包装细胞PT67,通过G418筛选得到稳定的产毒细胞株,电镜观察培养液上清中的病毒颗粒,同时病毒感染NIH3T3细胞测定其病毒滴度。结果表明,本研究克隆的牛Klf4基因开放阅读框序列与已发表序列(NM-001105385)比对有99.9%的高同源性;构建的重组载体质粒可正常包装,电镜下可观察到典型的病毒颗粒,筛选出的产毒细胞株病毒滴度达7.16×107CFU·mL-1。本研究成功构建的真核表达载体pMSCV-Klf4和得到的产毒细胞株,为进一步开展有关牛iPS细胞的研究奠定了基础。

人MDC1基因shRNA反转录病毒载体的构建及鉴定

目的建立反转录病毒介导的MDC1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MDC1表达的影响。方法将人MDC1基因的RNA干扰双链DNA片段重组到反转录病毒质粒pSilencer5.1-H1Retro中,构建携带人MDC1基因的RNA干扰反转录病毒载体psiRNA-MDC1。经PT67细胞包装后,产生的重组反转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定的细胞克隆。采用RT-PCR和Western blotting检测细胞中MDC1mRNA和蛋白表达的变化。结果重组psiRNA-MDC1质粒经测序鉴定正确;重组反转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western blotting检测人MDC1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人MDC1基因RNA干扰双链DNA片段的反转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MDC1mRNA和蛋白表达,为进一步研究MDC1在宫颈癌中的作用奠定了基础。

构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定

背景:增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白。研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达。目的:构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定。方法:用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN。用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析。结果与结论:从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750bp。构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750bp处有特异性条带。插入方向经PCR鉴定,350bp处有特异性条带。限制性内切酶法鉴定,750与6000bp处有特异性条带。DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%。结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向。

β-分泌酶底物肽反转录病毒载体及其包装细胞株的构建

目的用pLXSN反转录病毒载体构建介导β-分泌酶底物肽(BACEsp)基因表达的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立高效、稳定表达BACEsp的包装细胞株。方法根据BACEsp基因序列设计引物,PCR合成的BAC-Esp片段和pLXSN载体用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后连接,构建成表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体。用脂质体介导转染PT67包装细胞,经抗性筛选后,挑单克隆扩大培养,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出高效产毒细胞株。结果经酶切、连接后构建成的质粒称为pLXSN-BACEsp,经测序证实构建成功,无任何碱基突变。经脂质体介导转染包装细胞、抗性筛选和测定病毒滴度,筛选出具有高病毒滴度的细胞集落,扩大培养后建立BAC-Esp高效表达的包装细胞株。结论成功构建了能表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立了稳定、高效地产生有活性的BACEsp产毒包装细胞株。

NDRG2基因反转录病毒载体的构建及表达

背景:NDRG2(N-Myc Downstream Regulated Gene 2)是一个新的抑癌基因,既可以增强经典抑癌通路的抗肿瘤效应,又可以对正常细胞的癌变起到监控。有关NDRG2在骨髓瘤发生中的功能和作用至今还未见报道。目的:构建NDRG2基因反转录病毒表达载体,利用包装的病毒感染人骨髓瘤细胞系U266,检测NDRG2的表达情况。方法:设计与合成引物,提取U266细胞的RNA,反转录和PCR扩增,经BamHⅠ和TaqⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳,切胶回收进行连接转化,并再次酶切鉴定;并将构建的载体包装为反转录病毒,感染U266细胞,筛选出稳定表达NDRG2的U266细胞(U266-NDRG2)克隆扩大培养,利用Western blot实验检测筛选到的U266细胞中NDRG2的表达。结果与结论:成功构建了携带NDRG2基因表达的重组载体pBaba-puro-NDRG2,并包装为反转录病毒,筛选到的U266细胞(U266-NDRG2)中NDRG2蛋白表达明显高于U266-cherry细胞和U266细胞。结果可见利用反转录病毒载体基因重组技术成功构建出携带相应基因的反转录病毒,为研究NDRG2在人骨髓瘤中的作用奠定了实验基础。

VSV-G假型反转录病毒载体在基因治疗中的应用

VSV- G假型反转录病毒是一种新型的基因转移载体 ,具有滴度高 ,宿主范围广 ,抗补体灭活等优点。离体及活体基因转移研究表明 ,VSV- G假型病毒能够有效地将外源基因转移到多种靶细胞中 ,并获得稳定的转基因表达。本文就近年来 ,VSV- G假型病毒在造血细胞 ,免疫细胞 ,肝细胞 ,以及神经元细胞介导的基因治疗中的应用情况作简要综述 ,并展望其未来的发展前景。

一DXFD_（52）相关人肝细胞cDNA的部分序列分析及其反转录病毒载体的构建

为了寻找和研究新的人类基因ｃＤＮＡ，本实验以Ｔ７ＤＮＡ聚合酶对—ＤＸＦＤ＿（５２）相关人肝细胞ｃＤＮＡ（ＤＥ）进行了分段部分测序，并将所测各部分序列分别在ＥＭＢＬ（欧洲分子生物学库）中进行核酸同源性检索，结果在库中没有找到任何具有同源性的人类基因或ＤＮＡ（或ｃＤＮＡ）片段。因此，我们初步认为ＤＥ为一新的人类基因ｃＤＮＡ片段。同时为初步探讨ＤＥ的功能，我们还成功地将ＤＥ构建于反转录病毒载体ｐＬＸＳＮ上。

内含子在人凝血Ⅸ因子反转录病毒载体中的表达及剪接作用

构建了带有内含子的反转录病毒表达载体，研究内含子对hFⅨ的表达影响。反转录病毒载体经过PA317细胞包装后，稳定保留内含子是进一步研究内含子对hFⅨ表达影响的关键。首先构建了GlNaC－i－Ⅸ、GlNaC－i'-Ⅸ表达元件正向插入的反转录病毒载体。其中，GlNaC－i－Ⅸ带有源于IL－2的异源内含子，GlNaC－i'－Ⅸ带有来自hFⅨ自身的第一内含子；其中间部分顺序缺失，只包括剪接供体和剪接受体位点。用RT－PCR方法发现，反转录病毒介导基因转移的载体中的内含子都被剪切掉。为避免内含子的剪切，又构建了表达元件反向插入的反转录病毒载体GlNaC－i'－ⅨR、GlNaPAi'ⅨBAM。用同样的方法证明，反向插入载体中的内含子被保留下来。证明表达元件反向插入的反转录病毒载体可以得到稳定的含有内含子的表达载体，ELISA检测证明内含子能提高hFⅨ表达。为进一步提高hFⅨ在体外细胞和体内的表达水平提供依据。

反转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞

背景:为方便、准确检测外源细胞在体内的存活情况,需在外源细胞转移标记基因。目的:观察多种细胞因子联合刺激下反转录病毒载体对BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因转移效率的影响。方法:以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素6预培养刺激后的BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞,实验组实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率。阴性对照组不做基因转移。阳性对照组为PA317-GCGPXSN细胞株。结果与结论:①病毒滴度为1.9×108CFU/L。②对照组 BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞测定的荧光强度数值为0.63%,实验组为76.04%,两组相比差异有显著性意义(P<0.01)。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,结果证实细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因组中。

反转录病毒载体介导可溶性Fas的体外表达

将含全长FascDNA的质粒利用PCR技术进行特定片段删除 ,获得sFascDNA。通过DNA重组技术 ,将sFascDNA插入到反转录病毒载体 pLXIN ,构建了重组表达载体pLXIN sFas。经酶切鉴定及测序 ,表明成功地构建了重组表达载体 pLXIN sFas。该载体经PA317细胞包装后 ,感染靶细胞COS 7,分别采用ELISA及凋亡抑制实验检测其蛋白表达量为 (2 .2± 0 .7) μg/ml,且具有良好的生物学活性 ,能明显抑制抗 Fas(CH 11)介导的T淋巴瘤细胞株Jurkat的凋亡。

反转录病毒载体介导RNA干扰抑制EphA2在Hela细胞中的蛋白表达

目的:课题前期发现EphA2和配体EphrinAl在宫颈鳞癌细胞和肿瘤相关血管内皮细胞均呈高表达,为基因治疗宫颈癌提供了理想的靶向。以此为基础,利用反转录病毒载体介导的RNA干扰抑制EphA2在Hela宫颈癌细胞中的蛋白表达。方法:实验于2006-01/06在河南省肿瘤病理重点实验室完成。①实验材料:PA317细胞、Hela229细胞购自上海生化细胞所,小鼠NIH3T3细胞为本室保存。EphA2兔抗人多克隆抗体,Actin兔抗人多克隆抗体(美国SantaCruz公司)。②实验方法:从EphA2的mRNA全序列中筛选出1个19nt的靶序列,设计双链发夹结构。以siRNA互补双链寡核苷酸,构建反转录病毒表达载体pSIREN-EphA2,提取质粒,用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切进行鉴定。选择经酶切鉴定的正确克隆测序。挑选pSIREN-EphA2抗性克隆细胞扩增,检测转染后Hela细胞中EphA2蛋白的表达水平。结果:①pSIREN-EphA2重组质粒的酶切鉴定:双酶切后形成328bp和6182bp两条电泳条带。②pSIREN-EphA2重组质粒测序:结果与已知序列完全一致。③EphA2蛋白的表达:经Westernblot分析,重组pSIREN-EphA2转染的Hela细胞中EphA2蛋白表达水平明显降低。结论:通过反转录病毒载体介导的RNA干扰,能够抑制EphA2在Hela细胞中的蛋白表达,为以EphA2为靶点的宫颈癌基因治疗提供新的思路和手段。

反转录病毒载体介导含增强子的人β－珠蛋白基因在小鼠胎肝细胞中的表达

将人β－珠蛋白基因（３．１ｋｂ）反向克隆入反转录病毒载体Ｎ２Ａ，并在Ｎ２Ａ的ＬＴＲ插入３６ｂｐ的增强子ＨＳ２（简称Ｎ２Ａ．β．Ｅ３６）。将此反转录病毒重组体转染ψ－２和ＰＡ３１７包装细胞系，经Ｇ４１８筛选后，分离出完整整合的并能产生较高病毒滴度的产病毒细胞系。利用产病毒细胞系，将含增强子人β－珠蛋白基因转入小鼠胎肝细胞，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交表明人β－珠蛋白基因可以完整地整合到靶细胞的基因组上，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示人β－珠蛋白基因可在小鼠胎肝细胞中表达。

反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的表达

目的：利用反转录病毒载体构建猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白（APOBEC）3F重组质粒,并实现其在猪肾细胞PK15中的表达。方法：用RT-PCR方法扩增五指山猪来源的外周血淋巴细胞APOBEC3F基因,将其定点插入反转录病毒载体pMSCV neo中,同时于插入位点两侧分别添加FLAG和GFP标签,构建重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的重组质粒与pVSV-G、pGag-Pol共转染包装细胞HEK293T,分别于转染后48~72 h收集细胞的培养上清以获得假型病毒粒子;用该假型病毒感染猪源细胞PK15,通过PCR、Western印迹检测目的基因的整合及表达。结果：PCR扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP经酶切、测序,结果无误;3质粒共转染HEK293T细胞包装出的假型病毒感染PK15细胞后观察到GFP表达;从感染假型病毒的PK15细胞基因组中扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,Western印迹检测到78.1×103的猪APOBEC3F蛋白的表达。结论：实现了反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的整合与表达,为深入研究该分子对猪内源性反转录病毒（PERV）的抑制作用奠定了基础。

携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响

背景:端粒酶反转录酶对端粒酶的激活和活化有重要的作用,利用端粒酶反转录酶的慢病毒载体抑制星形胶质细胞表达对脊髓损伤修复的影响鲜见报道。目的:利用靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体转染大鼠星形胶质细胞,并观察端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响。方法:原代及传代培养大鼠星形胶质细胞。实验分为端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组、单纯慢病毒转染组和空白组,转染后并测其转染率,且在转染后的不同时间段测量大鼠星形胶质细胞的凋亡情况。结果与结论:端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组及单纯慢病毒转染组对星形胶质细胞的转染率达85%-90%。免疫荧光染色及流式细胞仪检测显示,端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组在转染后24-48h细胞凋亡率达50%-60%。在单纯慢病毒转染组及空白组细胞凋亡率并无显著改变。结果说明,携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体可促进大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡。

反转录病毒载体G_1NaCⅨ的构建及其在离体细胞中的表达

目的构建高效、安全、可用于基因治疗的反转录病毒载体G1NaCⅨ。方法用限制性内切酶Bg1Ⅱ和HindⅢ将CMV－FⅨcDNA从质粒pCMVⅨ－10上切下，将该片段与BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的G1Na连接，连接后的载体经鉴定连接正确后即为新载体G1NacⅨ，将G1NaCⅨ通过包装细胞PA317导入小鼠成纤维细胞NIH3T3、小鼠成肌细胞C2C12和人纤维肉瘤细胞HT1080中，选择培养两周后分别测定G1NaCⅨ在上述细胞中的Ⅸ因子表达量。结果（1）经酶切电泳鉴定，G1NaCⅨ连接正确；（2）G1NaCⅨ在N1H3T3中的Ⅸ因子表达量为60ng/106细胞·天-1，在C2C12中的Ⅸ因子表达量为1580ng/106细胞·天-1，在HT1080中的Ⅸ因子表达量为3600ng／106细胞·天-1，其中80％～90％的Ⅸ因子具有凝血活性。结论构建成功的反转录病毒载体G1NaCⅨ在C2C12和HT1080细胞中均能高效表达。