反转录聚合酶链式反应检测猪繁殖与呼吸综合征持续性感染

猪繁殖与呼吸综合征感染的特点之一是持续性的感染和病毒血症。本研究利用反转录聚合酶链式反应检测了PRRSV BJ- 4株单独感染 SPF仔猪和接种 PRRSV BJ- 4后再接种猪瘟疫苗不同时间的血清中病毒的存在。结果显示在感染2 4h后的血清样品中就发现有病毒 RNA存在 ,病毒血症至少持续到感染后 37天 ,到第 5 0天时已经消失。 PRRSV BJ- 4感染后再接种猪瘟疫苗的仔猪的 PRRSV病毒血症没有受到影响。这些结果提供了 PRRSV持续性感染的直接证据 ,解释了实际生产中通过引进临床正常但已经感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒的猪群造成猪场内病毒的传播和长期感染的存在 。

H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)M基因和HA基因序列设计了3对引物,其中1对为针对不同HA亚型AIV的通用引物,另外2对为分别针对AIVH5和H7亚型的特异性引物。这些引物所扩增的cDNA片段大小分别为244、860和634bp。利用这3对引物,通过对多重RTPCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别AIVH5、H7亚型的多重RTPCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术对AIVH5亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段;对AIVH7亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段;对AIVH5和H7亚型混合样品能同时扩增出3条大小分别为244、860和634bp的cDNA片段;对其他AIVHA亚型只扩增出1条244bp的cDNA片段;对其他常见禽病病原扩增均为阴性;该多重RTPCR对AIVRNA、AIVH5和AIVH7亚型RNA的最低检出量分别为10、100和100pg。

微流控振荡流反转录聚合酶链式反应快速检测烟草花叶病毒

建立了一种基于毛细管的振荡流反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的微流控装置检测烟草花叶病毒(TMV)的新方法。根据TMV移动蛋白基因设计一对PCR引物,对粗提纯TMV颗粒直接进行RT-PCR。用0.025%小牛血清蛋白(BSA)对反应毛细管内壁进行静力学和动力学钝化,提高了PCR效率。在此微流控装置上进行RT-PCR,流速为70μL/min时,检出限为0.01μg cDNA;可以在17min内成功扩增出179bp的目的DNA片段。

多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立

目的参考AIV M基因和HA基因序列,设计了两对引物。其中XZ145-2和XZ146为通用引物,可以检测所有亚型AIV,跨幅244 bp;XZ H9-1和XZ H9-2为H9亚型特异性引物,跨幅488 bp。方法利用这两对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。结果与结论特异性和敏感性试验结果表明,该技术对H9亚型AIV同时扩增出两条大小分别为244 bp和488 bp的cDNA片段,对其他亚型AIV只扩增出244bp的cDNA片段,对其他常见禽病病原无特异性扩增,结果为阴性;该多重RT-PCR的通用引物对AIV RNA的最低检出量为1pg,对H9亚型RNA的最低检出量为10 pg。

实时定量反转录聚合酶链反应检测患儿急性粒细胞性白血病1-ETO融合基因的临床意义

目的分析实时定量RT-PCR在检测急性粒细胞性白血病（AML）1-ETO融合基因阳性AML微小残留病中的临床意义。方法对2000年1月-2007年1月收治的32例AML1-ETO阳性AML患儿进行实时定量RT-PCR检测。诱导化疗结束后及在巩固化疗阶段每1.5-2.0个月行AML1-ETO融合基因定量检测。使用Kaplan-Meier法分析不同融合基因水平患儿生存率。采用SPSS10.0软件进行统计学分析。结果共32例患儿进行诱导化疗,其中29例（90.625%）达到形态学完全缓解,3例形态学未缓解后放弃。达到分子生物学缓解患儿有更高的无瘤生存率（P=0.0018）。AML1-ETO高拷贝数组生存率低于低拷贝数组（P=0.1080）。诱导缓解化疗结束后AML1-ETO定量结果示〉10^-3组生存率低于定量〈10^-3组生存率（P=0.0230）。化疗6个月时AML1-ETO定量结果示〉10^-3组生存率高于定量〈10^-3组生存率（P=0.0001）。巩固化疗结束时AML1-ETO定量〉10^-5组生存率低于定量〈10^-5组生存率（P=0.0049）。结论定量评估AML1-ETO阳性的小儿AML微小残留病十分重要,有可能对治疗方案的选择提供重要信息。

反转录聚合酶链式反应法检测端粒酶催化蛋白亚单位mRNA

目的 研究端粒酶催化蛋白亚单位（ｈＴＥＲＴ）ｍＲＮＡ在肿瘤组织中的表达情况，建立一种恶性肿瘤诊断的新方法。方法 提取肿瘤组织总ＲＮＡ，用反转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法进行检测。结果７６例各型肿瘤组织中６６例阳性，５例恶性胸腹水全部阳性。结论 ＲＴ－ＰＣＲ法检测 ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ是一种灵敏、简便的恶性肿瘤辅助诊断的新方法。

反转录聚合酶链式反应定量分析Ⅰ型脱碘酶的mRNA

Ⅰ型脱碘酶 (IDⅠ )是一种含硒酶 ,它在甲状腺激素代谢中起重要作用。本实验建立了利用RT PCR并以 β 肌动蛋白 (β Actin)为内参照定量分析IDⅠmRNA表达的方法。提取肉鸡肝脏总RNA ,经反转录和PCR扩增 ,PCR产物的电泳条带于VDS摄象系统扫描灰度。寻求PCR线性扩增范围 ,确定RT PCR的最佳循环次数和模板量。通过计算IDⅠPCR产物与β ActinPCR产物的灰度之比 ,即可得出IDⅠmRNA的相对含量。

反转录聚合酶链反应和核酸探针检测禽呼肠孤病毒研究的概述

根据禽呼肠孤病毒 (ARV )参考毒株S1 1 3 3S1基因序列 ,设计合成 4对引物而分别建立了RT -PCR、半套式PCR和一步法PCR三种用于检测ARV的方法。它们能检测到的最近ARVRNA量分别为 1pg、1fg和 0 1 6ngRNA ;研制出禽呼肠孤病毒地高辛核酸探针 ,并建立了地高辛核酸探针检测ARV的方法 ,该核酸探针最低能检测到 0 45ng的ARVRNA ;对广西部分鸡场血清学调查表明 ,ARV平均阳性率为 2 7% ;对广西ARV野毒株进行了分离和鉴定 ,并对获得的 2个地方分离株的S1基因片段进行测序及分析 ,两分离株与标准株S1 1 3 3的同源性分别为98 5 %和 98 3 % ;用所建立的RT -PCR和地高辛核酸探针方法对用ARV人工感染鸡采集的各种样品的检测 ,并和传统病原分离方法进行比较 ,结果RT -PCR检出率为 92 5 % ( 2 2 2 /2 40 ) ,地高辛核酸探针检出率为 74 2 % ( 1 78/2 40 ) ,病原分离鉴定方法检出率为 5 5 % ( 1 3 2 /2 40 )。用ARV强毒分别对免疫种鸡后代和无母源抗体或SPF的雏鸡进行攻毒试验 ,结果油苗免疫的种鸡后代对本病有很强的抵抗力 ,能抵抗ARV强毒的攻击 ,其平均保护率 90 8% ( 1 0 9/1 2 0 )。而无母源抗体或SPF的雏鸡攻毒后均 1 0 0 % ( 2 40 /2 40 )死亡。

介绍一种快速反转录聚合酶链反应

目的 介绍一种特异、高效的快速PCR方法。方法 总RNA分成 2份 ,采用相同反应体系 ,分别用普通PCR方法和快速PCR方法同时扩增FasL。结果 虽然两种方法均能成功扩增FasL基因 ,但普通PCR方法耗时 3h 4 8min ,而且还存在非特异性片段 ;而快速PCR方法耗时仅 2h 6min ,而且没有出现非特异片段。结论 快速PCR方法不仅极大的缩短了反应时间 ,同时提高了反应的特异性。

多重反转录聚合酶链式反应检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的研究

利用多重反转录聚合酶链式反应同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒.在GenBank中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析其相似性,利用Primer Premier 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物.这3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228和830 bp.结果表明,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228和830 bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原的核酸不存在交叉反应.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV cDNA的最低检出量分别为10 pg、1 ng和10 pg.

两种反转录聚合酶链反应检测甲型肝炎病毒

目的 建立一种灵敏、特异的 RT- PCR方法检测环境中的 HAV。方法 对两种 RT- PCR,即常规两步法 RT-PCR和一步法 RT- PCR检测 HAV的效果进行了观察 ,并采用半套式 PCR对扩增产物的特异性进行验证。结果 两种RT- PCR与半套式 PCR检测 HAV均得到预期条带 ,所设计的引物对其它的肠道病毒扩增呈阴性 ;在同等反应条件下 ,一步 RT- PCR的反应效率远高于常规 RT- PCR,二者的检测灵敏度也有显著性差异 ,一步 RT- PCR的检测灵敏度为 10TCID5 0 / ml,两步法 RT- PCR检测灵敏度为 10 3TCID5 0 / ml。结论 一步 RT- PCR较常规 RT- PCR易于操作 ,重复性好 ,不易污染 ,具有更高的反应效率和灵敏度。

排除β-肌动蛋白假基因对反转录聚合酶链反应的干扰

目的筛选合适的β-肌动蛋白(β-actin)引物以排除RNA样本中残存的DNA对人类基因表达分析的干扰。方法利用EMBL、PSEUDOGENE等生物信息数据库,寻找β-actin的假基因。同时自行设计和从国内外文献中筛选了众多β-actin引物。选用其中具有代表性的5对跨过内含子的引物,分别将基因组DNA、未经逆转录的RNA、cDNA作为模板,对这5对引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增。结果生物信息学分析发现β-actin有37个假基因并且发现绝大多数的研究者所使用的引物都存在假基因干扰问题。当分别用DNA和cDNA作为模板时,5对引物中的1对跨过内含子的引物能扩增出大小不同的条带。结论使用该对引物能有效发现和排除RNA样本中所残存的DNA的干扰,令人类基因表达分析得出更准确的结果。

竞争性反转录聚合酶链反应对髌韧带中的α_1-Ⅰ型胶原蛋白基因表达的定量检测

应用竞争性反转录聚合酶链反应技术,对韧带中的α_1-Ⅰ型胶原蛋白基因表达进行了定量测定。研究表明:该技术是适用于对一小块髂韧带中的基因表达进行定量研究。

实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测HLA-DRα基因mRNA表达

目的建立实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HLA-DRα基因mRNA表达。方法应用T-A克隆技术构建含HLA-DRα基因的载体作为标准模板,采用荧光Taqman方法及探针标记技术,建立实时荧光定量RT-PCR方法,制备标准曲线,检测牛膝多糖(ABPS)诱导人外周血单核细胞的HLA-DRαmRNA表达水平变化,并与半定量RT-PCR检测结果进行比较。结果实时荧光定量RT-PCR检测ABPS诱导人外周血单核细胞实验组HLA-DRαmRNA表达明显升高,而无ABPS诱导人外周血单核细胞对照组HLA-DRαmRNA表达没有改变,且半定量RT-PCR结果显示HLA-DRα出现类似的变化趋势。结论所建立的实时荧光定量RT-PCR用于检测HLA-DRαmRNA表达,结果用拷贝数表示,比半定量RT-PCR更灵敏、准确。

反转录聚合酶链式反应定量分析巨噬细胞炎症蛋白-2 mRNA

目的:建立反转录聚合酶链式反应定量分析巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)mRNA的方法。方法:以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照,通过优化RT-PCR条件定量MIP-2 mRNA的表达。结果:获取了PCR线性扩增范围,确定了RT-PCR的最佳循环次数和模板量。结论:优化的RT-PCR方法可以用于MIP-2 mRNA的分析。

反转录聚合酶链反应检测胃癌病人中心静脉血CK20mRNA表达及其临床意义

目的:运用巢式反转录聚合酶链反应(nest RT-PCR)技术,探讨细胞角蛋白20(CK20mRNA)在胃癌病人中心静脉血的表达及其临床意义。方法:nest RT-PCR检测胃癌病人中心静脉血及良性疾病病人中心静脉血CK20mRNA,表达情况与临床病理因素进行分析。结果:64例胃癌病人34例CK20mRNA阳性,阳性率为53.1%,良性病病人16例均阴性;胃癌病人血液CK20mRNA的阳性率与肿瘤大小、腹腔和肝转移、临床分期相关(P<0.05),与病理组织学类型无相关性(P>0.05);8例早期胃癌病人中2例CK20mRNA阳性。结论:扩增CK20mRNA的nest RT-PCR方法是检测胃癌病人中心静脉血微转移敏感而特异的方法。

反转录聚合酶链反应方法诊断肠道小RNA病毒性脑膜炎

目的评估RT-PCR方法诊断肠道小RNA病毒性脑膜炎的应用价值。方法对象包括脑膜炎组104例和对照组39例,检测脑脊液中肠道小RNA病毒应用RT-PCR方法。结果脑膜炎组的肠道小RNA病毒阳性率为41.3%(43/104),对照组未测出肠道小RNA病毒阳性结果。结论肠道小RNA病毒是导致脑膜炎的重要病原体,RT-PCR方法诊断肠道小RNA病毒性脑膜炎具有较高的应用价值。

反转录聚合酶链反应法检测端粒酶催化蛋白亚单位mRNA

为研究端粒酶催化蛋白亚单位(caltalytic protein subunits of telomerase,hTERT)mRNA在肿瘤组织中的表达情况,建立一种恶性肿瘤诊断的新方法,通过提取肿瘤组织总RNA,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法对76例各型肿瘤组织及5例恶性胞腹水进行了检测。结果表明,76例各型肿瘤组织中66例阳性,5例恶性胸腹水全部阳性,表明RT-PCR法检测hTERTmRNA是一种灵敏、简便的恶性肿瘤诊断的新方法。

荧光定量反转录聚合酶链反应用于GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的检测效能

目的探讨荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)用于GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的检测效能。方法选取2017年5月至2020年4月该院收治的有腹泻、腹痛、呕吐症状患儿40例,采集两份粪便样本检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒,均采用荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测方式,对比两种检测方式的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确率。结果常规RT-PCR对诺如病毒的检测灵敏度为82.4%(28/34),特异度3/6,阳性预测值90.3%(28/31),阴性预测值3/9,准确率77.5%(31/40)。荧光定量RT-PCR对诺如病毒的检测灵敏度为100%(34/34),特异度5/6,阳性预测值97.1%(34/35),阴性预测值5/5,准确率97.5%(39/40)。结论荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒均有一定的检测效果,但前者更准确。

反转录聚合酶链反应检测血液标本癌胚抗原mRNA诊断消化系统恶性肿瘤

目的探讨癌胚抗原 m RNA(CEA-m RNA)在诊断与鉴别诊断消化系统恶性肿瘤价值。方法以 5 4例消化道恶性肿瘤患者 (肿瘤组 )和 42例非恶性肿瘤的良性消化道患者 (非肿瘤组 )为研究对象 ,应用反转录聚合酶链反应 (RT-PCR)检测血液标本 CEA-m RNA。结果血液标本 CEA-m RNA阳性检测结果为恶性肿瘤组 3 1例 (5 7.4% ) ,非肿瘤组 1例 (2 .4% ) ,两组阳性结果的差异具有显著性 (P<0 .0 1)。血液标本 RT-PCR检测 CEA-m RNA指标诊断恶性消化系统肿瘤的特异性为 97.5 %、敏感性为 5 7.4%。结论在诊断与鉴别诊断消化系统恶性肿瘤等方面 ,CEA-m RNA是一个特异性和敏感性比较好且很实用的指标 。