双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

聚合酶链反应方法检测阴道毛滴虫准确性的meta分析

目的系统评价聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的应用价值。方法检索中国知网数据库(CNKI)、万方数据知识服务平台、维普数据库和PubMed数据库自建库到2023年5月30日以来基于PCR方法检测阴道毛滴虫的研究文献。经文献筛选、数据提取后,使用软件RevMan 5.4.1和网页服务Meta-Disc 2.0进行Meta分析。结果共纳入36篇文献,16454个临床样本。Meta分析结果显示:聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的合并敏感度为0.972(0.943,0.987),合并特异度为0.979(0.968,0.986),诊断比值比为1643.398(673.168,4012.008),阳性似然比为46.209(30.549,69.897)和阴性似然比为0.028(0.013,0.059);亚组分析表明不同性别的临床样本不会影响聚合酶链反应的检测准确性,但不同的PCR检测方法的准确性有差异。结论聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的准确性较高,具有良好的应用价值。

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

目的建立多重荧光定量聚合酶链反应法(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌的方法。方法根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×10^(2)CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×10^(2)CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×10^(2)CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。

荧光定量聚合酶链反应检测脑脊液中结核分枝杆菌DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎的应用价值分析

目的 探究荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测脑脊液中结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)的应用价值。方法 选择2019年7月—2021年6月于安陆市普爱医院就诊的存在脑膜刺激征的80例患者作为研究对象,所有患者均经MTB培养后明确诊断,将确诊为TBM的37例患者分入脑膜炎组,疑似TBM的18例患者分入疑似组,非TBM的25例患者分入非TBM组,对3组患者行腰椎穿刺,留取5 m L脑脊液及时送检,分别行MTB培养法、抗酸染色涂片法、荧光定量PCR检测。对比3种检测方法在MTB中的阳性检出率,对比脑膜炎组与疑似组患者MTB的DNA检测数值。结果 脑膜炎组应用荧光定量PCR检测MTB的阳性检出率高于疑似组,差异有统计学意义(P<0.05);脑膜炎组与疑似组采用MTB培养法、抗酸染色涂片法的MTB阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。脑膜炎组患者MTB的DNA检测数值为(4.71±0.97),疑似组患者MTB的DNA检测数值为(4.35±0.83),2组患者MTB的DNA检测值比较,差异无统计学意义(t=1.351,P=0.183)。结论 应用荧光定量PCR检测脑脊液中MTB的DNA,有助于判断TBM患者病情严重程度,在鉴别诊断TBM中具有较高的临床应用价值,为临床诊疗提供新思路及方向,值得临床推广应用。

反转录酶在微小RNA实时荧光定量聚合酶链反应中的作用

目的以微小RNA(miRNA)作为检测样本,考察影响实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结果的关键点,并筛选出最优的检测方法。方法采用3种miRNA提取方法(分别使用EasyPure^(■)miRNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒、TransZol Up Plus RNA提取试剂盒)和3种反转录方法(分别使用TransScript^(■)第一链cDNA反转录试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、miRNA第一链cDNA合成试剂盒)处理大鼠纹状体脑区,检测miRNA与c DNA的质量和效率,并使用常规RT-qPCR检测miRNA水平,比较不同方法所得结果。结果3种RNA提取方法得到的miRNA质量和效率比较差异均有统计学意义,其中方法2的效果较好,但方法1、2、3的RT-qPCR结果比较差异无统计学意义(miR-132:25.91±9.79、25.26±10.25、27.28±7.39,miR-U6:27.98±11.25、25.98±9.78、29.62±9.65,均P>0.05);3种反转录方法所得实验结果比较差异有统计学意义,方法3所得结果明显低于方法1、方法2(miR-132:16.53±3.17比35.20±1.06、31.42±2.95,miR-U6:16.63±1.73比36.06±2.57、35.59±1.54,均P<0.05),主要影响RT-qPCR的扩增效率和扩增特异性。结论使用能高效富集约18 nt大小RNA的提取方法和在miRNA的3’末端加多聚A尾(Poly A)的反转录酶,可以得到更可靠的RT-qPCR结果。

巢式多重聚合酶链反应快速诊断儿童脑膜炎/脑炎

目的探讨巢式多重聚合酶链反应(PCR)在儿童脑膜炎/脑炎诊断中的价值。方法采用回顾性病例对照研究。收集2017年5月—2020年5月上海市儿童医院82例确诊或疑似中枢神经系统感染患儿的脑脊液样本。收集患儿临床资料,了解患儿抗菌药物使用情况。采用巢式多重PCR检测病原体,并同步进行细菌培养、脑脊液常规和生化检测。结果82例脑脊液样本中,有31例检出病原体,其中20例检出病毒、11例检出细菌。细菌组脑脊液样本白细胞计数、蛋白、乳酸脱氢酶和患者抗菌药物使用天数、住院天数均显著高于病毒组(P<0.05);葡萄糖水平低于病毒组(P<0.05);阿昔洛韦使用例数少于病毒组(P<0.05)。巢式多重PCR与培养法判断细菌性脑膜炎/脑炎的一致性较好(Kappa=0.659,P<0.001),与实验室指标判断病毒性脑膜炎/脑炎的一致性亦较好(Kappa=0.737,P<0.001)。结论巢式多重PCR可以作为辅助诊断中枢神经系统感染患儿脑脊液样本病原体感染的新方法,可提高儿童脑膜炎/脑炎的诊断效率。

荧光聚合酶链反应法用于新型冠状病毒核酸检测扩增产物污染治理的相关应用

目的探讨荧光聚合酶链反应(PCR)法用于新型冠状病毒(新冠病毒)核酸检测时扩增产物污染治理的相关应用。方法建立新冠病毒基因检测扩增产物污染模型、物面污染模型以及空间(气溶胶)污染模型,比较不同化学试剂及物理紫外线照射治理方式对物面污染和空间污染的清除效果。结果75%乙醇消毒剂组、核酸清除剂组和不同浓度有效氯制剂组的循环阈值(CT值)均明显高于对照组,其中核酸清除剂组的CT值最高,玻璃、塑料、金属材质的CT值分别为34.74±2.63、34.68±3.25、35.71±3.07。500、1000、1500、2000、2500 mg/L有效氯制剂组对不同材质的CT值均高于75%乙醇消毒剂组,且有效氯的浓度越高,CT值越大,差异均有统计学意义。不同时长紫外线照射各组的CT值均明显高于对照组;其中以紫外线照射120 min组的CT值最高,玻璃、塑料、金属材质的CT值分别为35.51±2.70、35.49±2.63、35.55±2.58,且紫外线照射时长越长,CT值越大,差异均有统计学意义。治理后的通风+紫外线照射120 min+75%乙醇消毒剂+核酸清除剂+2500 mg/L有效氯制剂组的CT值为36.98±3.47,明显高于治理前及其他各组,差异均有统计学意义。结论荧光PCR法用于新冠核酸检测时扩增产物污染的治理方式较多,对物面污染的治理方式可选择核酸清除剂及2500 mg/L有效氯制剂,以及紫外线照射120 min,对空间污染环境的治理方式可选择通风+紫外线照射120 min+75%乙醇消毒剂+核酸清除剂+2500 mg/L有效氯制剂联合应用,值得重视。

抗原检测及聚合酶链反应在医院甲乙型流感病毒检测中的应用

目的分析抗原检测及聚合酶链反应(PCR)在医院甲、乙型流感病毒检测中的临床应用价值,以期为临床早期诊断、制定治疗方案提供参考。方法选取河南省洛阳市中心医院2020年1月至2023年1月诊治的120例疑似流感患者作为研究对象,入院后均采集咽拭子标本,采用抗原(胶体金法)检测甲、乙型流感病毒,实时荧光定量PCR法检测甲、乙型流感病毒核酸,比较胶体金法、实时荧光定量PCR法检测甲、乙型流感病毒的性能,分析胶体金法、实时荧光定量PCR法的稳定性及不同病毒核酸载量的胶体金法检测敏感性。结果120例疑似流感患者胶体金法检测阳性89例(甲型49例、乙型40例),实时荧光定量PCR法阳性98例(甲型55例、乙型43例);两种方法特异度、敏感度相近,胶体金法检测用时仅为15 min,实时荧光定量PCR法用时需要3 h,胶体金法检测时间明显少于实时荧光定量PCR法;2种方法检测从性别、季节、年龄方面比较对阳性结果影响差异均无统计学意义(P>0.05);胶体金法甲型流感病毒检测阳性、阴性样本核酸载量平均值比较差异有统计学意义(P<0.001);乙型阳性、阴性样本核酸载量平均值比较差异有统计学意义(P<0.001);2种试剂盒敏感性与标本病毒核酸载量呈正相关。结论胶体金法抗原检测及PCR均可用于医院甲、乙型流感病毒检测中,为临床筛查流感病毒提供参考,以制定相应干预方案。

不同激素处理下番茄实时荧光定量聚合酶链反应内参基因的筛选

为筛选出在不同激素诱导下番茄中较为稳定的内参基因,本研究以脱落酸(abscisic acid,ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、水杨酸(salicylic acid,SA)3种外源激素分别诱导处理0、24、48、120 h的感病番茄品种‘Moneymaker’(MM)和抗病番茄自交系62579叶片为试验材料,通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)进行扩增,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个软件分析EF1α、L33、Act、Ubi、GAPDH、UK、CAC、TIP41这8个番茄候选内参基因的表达稳定性。结果表明,8个候选内参基因的平均CT值为26~34。综合3个软件的分析结果发现,在ABA诱导下,番茄中较稳定表达的内参基因为L33和Ubi;在MeJA诱导下,番茄中较稳定表达的内参基因为L33和EF1α;在SA诱导下,番茄中较稳定表达的内参基因为EF1α和L33。综上所述,L33基因是番茄在不同激素诱导下表达最稳定的候选内参基因。本研究筛选的最稳定内参基因将为后续番茄响应外源激素处理的差异基因表达分析和分子机制研究提供校准依据。

聚合酶链反应配合腺苷脱氨酶和癌胚抗原检测鉴别诊断结核性和癌性胸腔积液的价值

目的分析聚合酶链反应配合腺苷脱氨酶和癌胚抗原检测对鉴别诊断结核性和癌性胸腔积液的价值。方法选取2018年1月至2022年1月普宁市人民医院收治的40例胸腔积液患者作为研究对象,根据病理检查结果分为观察组(癌性胸腔积液,共20例)和对照组(结核性胸腔积液,共20例)。两组患者均行胸腔积液样本采集,采用聚合酶链反应测量胸腔积液结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)阳性率,采用酶速率法检测腺苷脱氨酶(ADA),采用电化学发光法测量癌胚抗原(CEA)。比较两组患者检测结果的差异,并比较不同指标与三个指标联合应用的敏感度、特异度、准确度的差异。结果观察组胸腔积液TB-DNA阳性率以及ADA含量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组胸腔积液CEA含量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);胸腔积液TB-DNA联合ADA及CEA检查的敏感度与准确度高于单独胸腔积液TB-DNA、ADA、CEA检查,差异有统计学意义(P<0.008);胸腔积液TB-DNA联合ADA及CEA检查的特异度高于单独胸腔积液TB-DNA、ADA检查,差异有统计学意义(P<0.008);胸腔积液TB-DNA联合ADA及CEA检查与胸腔积液CEA的特异度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论胸腔积液TB-DNA联合ADA及CEA检查在鉴别诊断结核性与癌性胸腔积液中具有较高的敏感度与准确度,可推广使用。

微滴式数字聚合酶链反应在重症感染病原学诊断中的应用进展

重症感染是导致人类死亡的主要病因之一,尤其对于重症监护病房患者,传统的病原微生物检测手段存在灵敏度和特异度低、耗时长等问题,严重影响脓毒症患者病原学早期快速诊断,导致其病死率增加。近年,随着分子诊断技术在重症感染疾病中的广泛应用,病原学的诊断效率及准确性均显著提高。其中,微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)凭借高灵敏度、高特异度、绝对定量等优势,在病原菌载量动态监测和抗生素疗效评估中具有巨大潜力。因此,ddPCR技术或可提高重症患者的诊断率,改善其预后。

基于三重实时荧光聚合酶链反应构建黄牛和牦牛源性成分同步检测方法

目的建立一种拥有内源质控的三重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,用以快速鉴定肉和乳中黄牛和牦牛的源性成分。方法首先对黄牛肉、牦牛肉、黄牛奶、牦牛奶等7种动物产品进行特异性检测,同时通过稀释梯度方法验证此方法的绝对检出限(limit of detection,LOD),最后通过黄牛和牦牛肉掺假模拟试验确定该方法的相对灵敏度。结果该方法的特异性强,能特异性地检测到来源于黄牛和牦牛肉和乳的DNA,稳定扩增的内源质控有效地避免了假阴性结果,本方法针对黄牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10‒3 ng,针对牦牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10^(‒2)ng,本方法对黄牛肉和牦牛肉混合肉的相对灵敏度可达0.1%牦牛肉。结论所建立的三重实时荧光PCR方法特异性强、灵敏度高,可实现黄牛和牦牛源性以及内源质控的同步检测,又能通过内源质控排除实验假阴性结果。

犬瘟热病毒反转录-聚合酶链反应诊断方法的建立和初步应用

根据Ｂａｒｅｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的融合蛋白基因序列，设计合成了一对能扩增３２４ｂｐ基因片段的引物。将异硫氰酸胍－酚－仿一步法提取得到的细胞总ＲＮＡ进行反转录，以此产物为模板进行ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ扩增条件进行了优化。经鉴定，以此对引物进行的ＰＣＲ扩增，得到了与设计片段大小和酶切位点相同的产物，且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的三种病原的核酸，这表明此方法为特异性的。对２７条（只）临床病例和３２份细胞培养物进行检查，并与电子显微镜负染检查结果进行了比较。初步应用研究的结果表明，此方法可用于犬瘟热病毒的临床诊断和实验研究。

实时荧光聚合酶链反应检测新型冠状病毒室内质控方法初探

目的绘制实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)定性室内质控图和基于循环阈值的Levey-Jennings质控图,探究新型冠状病毒RT-PCR检测的室内质控方法。方法使用无菌生理盐水按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40对第三方质控物进行倍比稀释,确定室内弱阳性质控的稀释倍数。统计该实验室2022年1-2月新型冠状病毒RT-PCR阴阳性质控原始记录,以自定义数值绘制定性结果散点图。统计2022年1-2月每批次弱阳性质控的靶基因Ct值,分别对N基因和ORF1ab基因两组Ct值进行正态分布检验,根据前20次检测结果分别计算N基因和ORF1ab基因的靶值X和标准差s,绘制Levey-Jennings质控图。结果确定1∶30为每日室内质控的弱阳性质控品的稀释倍数。定性检测散点图可直观发现1次弱阳性质控检出阴性的“假阴性”反应。弱阳性质控N基因、ORF1ab基因Ct值均符合正态分布(P>0.05)。N基因Ct值靶值X为34.13,变异系数为1.91%,所有Ct值均在X±3 s以内,5次出现±2 s警告,符合Westgard质控规则。ORF1ab基因Ct值靶值为35.30,变异系数为2.58%,出现1次+3 s失控,5次±2 s警告,第31~41批次违反了10x规则,第73~80批次违反了R 4s规则。结论应用定性室内质控散点图和Levey-Jennings质控图建立的新型冠状病毒室内质控方法具有可行性,能够有效监测和预警检测过程中的质量问题,保证检测结果准确可靠。

基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术检测EV-A71 RNA及其与病毒3D聚合酶的相互作用

RNA荧光原位杂交(RNA-fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH)技术利用荧光标记的核苷酸探针,通过互补链杂交,对细胞或组织中特定的RNA序列进行检测和定位。由于RNA-FISH产生的阳性信号较弱,需要结合特异性信号放大,提高信噪比。但传统信号放大技术的背景难以消除,无法定量且分辨率低,是RNA-FISH技术应用的巨大障碍。本文基于第3代杂交链反应(hybridization chain reaction version 3.0,HCR v3.0),利用一对分裂式探针消除非特异杂交背景,并引发荧光信号放大反应,建立了针对肠道病毒A71(enterovirus-A71,EV-A71)RNA的敏感、特异的FISH检测方法,并将该技术与蛋白免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测结合,通过高分辨率激光共聚焦成像,成功地在单个细胞水平上检测了EV-A71感染细胞后病毒RNA与其聚合酶3D蛋白的分布变化和相互作用情况,并对细胞中病毒RNA和3D蛋白进行定量。发现相较于传统定量方法,如逆转录定量聚合酶链反应和免疫印迹,新一代RNA-FISH技术在单个细胞水平上病毒RNA和3D聚合酶的表达情况与群体细胞检测的结果在趋势上有明显差异。这说明,基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术,可以克服群体细胞数量增减掩盖病毒组分变化的缺点,从而真实反映病毒在单个细胞中的变化。

用逆转录—聚合酶链反应检测马铃薯卷叶病毒

用逆转录—聚合酶链反应检测马铃薯卷叶病毒张彤，哈斯阿古拉，张鹤龄，刘莉（内蒙古大学生物工程中心，呼和浩特，０１００２１）关键词卷叶病毒，反转录－ＰＣＲ，诊断马铃薯卷叶病毒（Ｐｏｔａｔｏｌｅａｆｒｏｌｌｖｉｎｉｓ，ＰＬＲＶ）属黄化病毒组（Ｌｕｔｅｏｖｉ...

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒

建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2+)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55℃,c(Mg2+)为2 mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38 CCID50.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中.

逆转录聚合酶链反应检测结直肠癌淋巴结微转移的临床意义

背景与目的:结直肠癌淋巴结微转移灶是否有预测预后价值目前尚有争议,本文对结直肠癌患者淋巴结微转移情况进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测,研究微转移对临床分期和预后的影响。方法:用RT-PCR技术检测56例结直肠癌患者肠旁及系膜淋巴结中细胞角质蛋白CK20mRNA,揭示微转移灶的存在,并与常规病理苏木精伊红(HE)染色和免疫组化染色结果进行比较;分析HE染色和RT-PCR检测结果对判定临床病理分期和统计生存率的影响。结果:共检测432个淋巴结,HE染色、免疫组化染色和RT-PCR法淋巴结转移检出率分别为57.2%、62.3%和73.1%。HE染色和免疫组化的检出率无显著性差异(P>0.05),而HE染色和RT-PCR法检测结果有显著性差异(P<0.05)。56例患者中,按HE染色结果确定的PN0、PN1和PN2期,其5年无复发转移生存率分别为80%、60%和50%;通过RT-PCR技术检测,升级后的PN0、PN1和PN2期5年无复发转移生存率分别为100%、61.9%和55.6%,两种方法分析的结果有显著性差异(P<0.05)。结论:HE染色未确切指出淋巴结微转移癌;RT-PCR法检测CK20mRNA可以推断淋巴结微转移癌的存在,从而有助于确定结直肠癌临床分期和预测预后。

应用反转录聚合酶链式反应快速检测蕃茄环斑病毒

应用反转录聚合酶链式反应快速检测蕃茄环斑病毒陈京，胡伟贞，于嘉林，韩成贵关键词反转录聚合酶链式反应，蕃茄环斑病毒近年来发展起来的分子生物学新技术一聚合酶链式反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）已在检测和分子生物学研究等许多领...

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。