双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价

为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性,本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA≥100 IU/mL 81例、HBV DNA<100 IU/mL 76例,以及作为对照的非HBV感染患者55例。采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中,SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)。2种方法具有较好的相关性与一致性(R 2=0.803和CCC=0.882)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1 log copies/mL,相对偏倚为0.97%。配对t检验显示,结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者血清样本中,HBV RNA阳性检出率不同,SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为88.16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R 2=0.326和CCC=0.438)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.5 log copies/mL,相对偏倚为0.86%。配对t检验显示,结果有统计学差异(t=3.654,P<0.001)。在非HBV感染对照患者中,SAT和qRT-PCR均未检出HBV RNA阳性。结果提示,在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中应用SAT与qRT-PCR检测血清HBV RNA,其相关性与一致性较好,在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者中相关性与一致性存在一定差异。

基于逆转录重组酶聚合酶扩增技术的苹果病毒新型快速检测方法

利用逆转录重组酶聚合酶扩增技术(Reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA),为苹果病毒的快速检测提供技术支持。以苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)和苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)为检测对象,通过特异性RPA引物设计以及反应条件优化,对检测方法的灵敏度、特异性进行评价,并与传统RT-PCR方法进行比较。结果表明,所设计的RPA引物特异性高,反应温度为37℃,反应时间为20 min,RT-RPA对4种苹果病毒的检测灵敏度为9.63×10^(1) copies,是普通RT-PCR的10^(2)~10^(3)倍。所建立的RT-RPA检测方法具有等温反应、检测速度快、灵敏度高等优点,可以用于快速检测苹果病毒病。

柑橘叶斑驳病毒的逆转录重组酶聚合酶扩增检测

【目的】建立柑橘叶斑驳病毒(citrus leaf blotch virus,CLBV)逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA)的快速检测体系,为该病毒提供快速、简便的检测方法。【方法】以CLBV ORF1保守序列为靶标,通过设计、筛选特异性检测引物、优化反应温度和反应时长等条件建立CLBV的RT-RPA检测体系。分别以感染CLBV、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)、柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)、柑橘裂皮类病毒(citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘碎叶病毒(citrus tatter leaf virus,CTLV)、柑橘鳞皮病毒(citrus psorosis virus,CPsV)、温州蜜柑萎缩病毒(satsuma dwarf virus,SDV)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)和柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)的柑橘核酸为模板,应用该体系进行RT-RPA扩增,评价检测特异性;利用CLBV阳性样品核酸的10倍浓度梯度稀释模板,比较RT-RPA、RT-PCR和RT-qPCR的检测灵敏度;通过比较上述3种方法对72份柑橘样品的CLBV检出率,检验所建立RT-RPA法的适用性。【结果】以感染了CLBV的柑橘核酸样品为模板,通过对设计的3对引物筛选试验、6个温度和5个反应时长的梯度试验,建立了CLBV的RT-RPA检测体系,明确引物RCLBV-F/RCLBV-R2能够特异扩增CLBV ORF1序列,且扩增效果良好,目的片段大小为144 bp,反应最适温度为40℃,反应最佳时长为30 min。在感染CLBV、CTV、CYVCV、CEVd、CTLV、CPsV、SDV、Xcc和CLas的柑橘样品、健康对照和空白对照中,该体系仅在CLBV侵染样品中扩增出预期大小的特异性目的条带,说明建立的RT-RPA检测体系特异性强;灵敏度检测结果表明,RT-RPA和RT-PCR的检测灵敏度相当,但低于RT-qPCR;所建立的RT-RPA方法在72份柑橘样品中检测出11份样品为CLBV阳性,检出率为15.28%,该结果与普通RT-PCR和RT-qPCR检测方法的检测结果一致。【结论】建立了CLBV的RT-RPA检测体系,该体系具有耗时短、操作简便、特异性强等优点,适用于田间一定规模柑橘样品的检测。

四重逆转录重组酶聚合酶等温扩增技术快速联检四种难鉴别蚊媒病毒的效果观察

目的建立针对登革病毒(DENV)、黄热病毒(YFV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、寨卡病毒(ZIKV)的四重逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)技术,用于同时快速检测上述4种病毒。方法通过正交设计建立检测4种蚊媒病毒(DENV、YFV、CHIKV、ZIKV)的四重RT-RPA反应体系。通过质粒标准品、体外转录RNA和临床血清验证单重RT-RPA和四重RT-RPA的检测灵敏度、特异度、重复性和临床应用符合率。结果单重RT-RPA对DENV、YFV、CHIKV、ZIKV质粒DNA的检出限分别为1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2)、<1×10^(2) Copies/ml,对DENV、YFV、CHIKV和ZIKV体外合成RNA的检出限分别为1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2) Copies/ml,四重RT-RPA对DENV、YFV、CHIKV和ZIKV质粒DNA的检出限分别为1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2) Copies/ml,对体外合成RNA的检出限分别为5×10^(2)、5×10^(2)、5×10^(2)、5×10^(2) Copies/ml。本研究建立的单重及四重RT-RPA反应体系与其他常见病毒不存在交叉反应,RT-RPA法测定的阈值时间值(TT)的变异系数为1.76%~5.96%。四重RT-RPA法对不同病毒体外转录RNA检出率不同,DENV、YFV和CHIKV为100.00%,ZIKV为83.33%。单重RT-RPA、四重RT-RPA、RT-PCR对DENV临床样本的检出率无统计学差异(P>0.05)。结论本研究建立的针对DENV、YFV、CHIKV和ZIKV的单重RT-RPA和四重RT-RPA检测方法特异度好、灵敏度高、重复性好,对蚊媒传染病的早期诊断及鉴别诊断具有重要作用,同时也为其他新发再发传染病的快速诊断方法建立提供研究方向。

反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)快速检测基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)快速检测方法。结果显示:该方法在40℃恒温孵育25 min即可完成靶序列扩增;特异性强,和猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均无交叉反应;灵敏度高,最低检出限为2×10^(0)TCID_(50)/μL,是常规RT-PCR方法的10倍;应用该方法对39份疑似PRRSV感染的临床样品进行检测,检出阳性样品25份,和实验室前期建立的荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。以上结果说明,本研究建立的RT-RAA检测方法简便快速、特异性强、灵敏度高、临床适用性好,为PRRSV感染的快速诊断提供了新的技术手段。

重组酶聚合酶扩增技术在人偏肺病毒快速诊断的方法建立与临床评价

目的:研究重组酶聚合酶扩增技术在人偏肺病毒(hMPV)快速诊断的方法建立与临床价值。方法:将2017年1月—2019年12月医院收治的急性呼吸道感染患儿200例纳入研究。分离获取hMPV阳性病毒株,检索Genbank数据库,检索hMPV株基因序列,采用生物信息学软件通过靶向特定区域,对hMPV的N基因和L基因2个位点进行检测,并设计引物及荧光探针,使用病毒株和阴性对照品对基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测hMPV的方法进行性能评估。同时,对所有受试者均进行直接荧光免疫法检测。以逆转录—聚合酶反应(RT-PCR)检测结果为金标准,对比不同检测方式诊断hMPV的效能。此外,分析hMPV感染患者合并其他病毒感染情况。结果:以RT-PCR检测结果为金标准,重组酶聚合酶扩增技术诊断hMPV的灵敏度、特异度、准确度均明显高于直接荧光免疫法检测(均P<0.05)。hMPV感染患者合并其他病毒感染发生率为26.83%,其中主要涵盖冠状病毒9.76%、呼吸道合胞病毒7.32%、流感病毒4.88%等。结论:重组酶聚合酶扩增技术在hMPV快速诊断中的应用效果较佳,可获得较为理想的灵敏度、特异度以及准确度,有望成为替代传统PCR的有效检测方式,值得临床推广应用。

转录介导的扩增技术与real-time RT-PCR在人类免疫缺陷病毒检测中的应用

目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚合酶及PCR底物等建立TMA扩增体系。通过扩增一组10倍梯度稀释的HIV RNA转录标准品,评价TMA体系的灵敏性。收集60例HIV感染患者的血浆,同时采用TMA试剂与Cobas Amplicor HIV-1 Monitor 1.5版试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用线性回归和Bland-Altman法分析两种技术的相关性和一致性。结果:成功建立了TMA扩增体系,这种技术可以检测低至10 copies/m L的HIV转录标准品。60份HIV感染者血浆样本中,TMA及Cobas均检测到阳性46份,均阴性12份,TMA检测阴性而Cobas检测阳性样本2份,检测一致率为96.7%。两种技术阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中46份TMA检测和Cobas检测均有定量结果的血浆进行线性回归分析,两种技术有非常好的相关性(r=0.997,P<0.001)。Bland-Altman分析显示两种检测方法定量Lg差值平均值为0.02,44份(95.7%)样本在95%的一致性界限内。结论:TMA技术具有高灵敏性潜能。TMA与real-time RT-PCR检测血浆中HIV RNA具有非常好的相关性与一致性。

逆转录环介导等温扩增技术

逆转录环介导等温扩增技术（Reverse Transcription Loop,Mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP）是一种新颖的RNA扩增方法。其基本原理是采用4到6条特异引物（针对基因的6到8个区域）及一种具有链置换活性的DNA聚合酶和AMV反转录酶．

环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒

【目的】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究拟用该技术建立菊花中番茄不孕病毒(TAV)的检测方法。【方法】设计能识别TAV CP序列6个特定区域的4种LAMP特异引物,对MgCl2、dNTPs、甜菜碱等LAMP反应条件进行优化,利用新建的LAMP法检测TAV,比较LAMP和RT-PCR2种不同方法的检测灵敏度。【结果】建立了检测番茄不孕病毒的LAMP技术;LAMP比RT-PCR具有灵敏度更高、快速、简便等优点。【结论】建立的LAMP技术能快速、准确、简便地检测出菊花中的番茄不孕病毒。

环介导等温扩增技术检测建兰花叶病毒

为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到LAMP检测快速检测方法。所建立的检测方法比RT-PCR更灵敏;且具有特异性,操作简单,不需要复杂的仪器,肉眼可直接观察检测结果。适合基层和现场检测。

2a/Ⅲ型丙型肝炎病毒基因组非结构4区全长序列的扩增、克隆及分析

目的 获得 2a/Ⅲ型丙型肝炎病毒 (HCV)基因组全长非结构 (NS) 4区克隆并作序列分析。方法 用限制性片段长度多态性分析 (RFLP)基因分型方法筛选出 2a/Ⅲ型HCV一株。为了获得该毒株全长NS4区基因序列 ,依据代表株序列的NS3区之 3′末端及NS5区之 5′末端相对保守区域合成引物 ,以RT -nested -PCR方法扩增一段 1.3kb的片段cDNA ;将此片段插入pUC19质粒载体。结果 克隆了丙型肝炎基因组非结构NS4区全长基因 ,构建了pUC -NS4重组体 ,对重组体进行酶切鉴定 ,克隆的cDNA与预计的片段大小相符 ,并作序列测定。结论 获得全长NS4区基因克隆 ,经序列分析表明 ,与日本HC -J6有较高的同源性 (92 .1%)。

甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-RPA-LFD检测方法的建立与应用

【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(west African strain,WA)的RT-RPA-LFD检测方法。【方法】根据SPCSV-WA外壳蛋白基因和热激蛋白基因的保守序列设计并筛选扩增效果好、特异性强的引物和探针。然后对引物和探针的浓度、扩增体系、温度、反应时间等条件进行优化,建立SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法。利用该方法对SPCSV-EA、甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(sweet potato virus G,SPVG)等常见的甘薯病毒进行检测,验证方法的特异性;将感染SPCSV-WA甘薯叶片样品总RNA进行10倍梯度稀释,分别采用RT-PCR和RT-RPA-LFD进行检测,比较RT-PCR和RT-RPA-LFD方法的灵敏度;对采自田间的甘薯样品和试管苗样品进行RT-RPA、RT-RPA-LFD和RT-PCR检测,验证该方法的实用性。【结果】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,最适引物为CSV357F/R,探针CSV-CP-Probe(47 bp),引物和探针工作浓度分别为0.2和0.06μmol·L^(-1),温度为42℃,时间5 min。该方法可对SPCSV-WA进行特异性检测,与甘薯上其他常见病毒无交叉反应。RT-RPA-LFD最低可检测到总RNA稀释至10^(-4)溶液,而RT-PCR最低检测到总RNA稀释至10^(-3)溶液,RT-RPA-LFD灵敏度是RT-PCR的10倍。田间采集的22份甘薯样品经RT-PCR、RT-RPA和RT-RPA-LFD检测,均检出11份阳性样品,3种方法检测结果一致。28份试管苗样品的检测结果表明,RT-PCR和RT-RPA-LFD检测结果一致,均检出5份阳性样品。【结论】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,该方法具有快速、简便、特异、灵敏、可视的特点,既可用于甘薯脱毒试管苗样品的病毒检测,也适用于基层单位田间甘薯病毒样品的现场快速检测。

环介导等温扩增技术在SARS-CoV-2核酸检测中的应用研究

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的高度传染性导致全球SARS-CoV-2感染病例迅速增加。寻找一种较传统实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术更加准确、快速的检测方法对疾病确诊及疫情防控尤为重要。环介导等温扩增技术(LAMP)与反转录酶相结合(RT-LAMP)已成功应用于SARS与中东呼吸综合征的检测,在SARS-CoV-2检测中亦表现出潜在优势。该文对SARS-CoV-2的结构特点、人类感染机制、LAMP的检测原理及其在SARS-CoV-2检测中的应用研究进展进行详细综述,以期为临床提供一种较RT-PCR更加快速、特异且具有明显成本-效益的SARS-CoV-2核酸检测方法。

NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计引物、crRNA,经优化反应条件后,建立了NoV GⅡ.2亚型RTRPA-CRISPR/Cas12a检测方法。结果显示:利用引物NoV-GⅡ.2-F1B和NoV-GⅡ.2-R1对NoV GⅡ.2标准RNA进行RT-RPA扩增,结合crRNA1介导的CRISPR/Cas12a报告体系,能在40 min内完成NoV GⅡ.2核酸检测;该方法检测灵敏度为10 copies/μL,且与轮状病毒、腺病毒、星形病毒、人副肠孤病毒、博卡病毒和札如病毒无交叉反应;应用该方法和qRT-PCR法,分别对30份临床模拟样本进行检测,发现总符合率达96.67%。结果表明,本研究建立的NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法无需依赖昂贵设备,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷快速等特点,为NoV GⅡ.2感染的现场检测和防控提供了新方法。

重组酶介导恒温扩增快速检测人鼻病毒的方法学研究

目的采用反转录重组酶介导核酸扩增技术(reverse transcriptase recombinase aided amplification,RT-RAA)建立检测人鼻病毒的快速方法。方法根据NCBI基因库中人鼻病毒保守序列设计引物及探针,将人鼻病毒RNA反转录为cDNA,然后使用反转录酶,以cDNA作模板,扩增检测人鼻病毒核酸序列。研究采用构建带有人鼻病毒核酸序列的质粒,检测不同浓度的质粒分析该方法的灵敏度,采用已知样本检测方法的特异性。结果设计的人鼻病毒特异性引物和探针,能有效扩增出相应病毒的核酸,而与其他病毒无交叉反应。该反应条件为39℃恒温,扩增结果用时30 min,最低扩增拷贝数为100拷贝。结论建立的RT-RAA检测人鼻病毒方法灵敏度和特异性高,反应快速、操作简单,适用于人鼻病毒的快速检测。

口蹄疫病毒real-time RT-RPA检测方法的建立与应用

为了建立口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,试验以FMDV 3D基因作为靶基因设计引物和探针,建立了一种新的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(real-time RT-RPA)检测方法,该方法在40℃恒温条件下20 min内完成检测,并评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果表明:该检测方法能特异性检测FMDV,敏感性为500拷贝/反应,而且具有很好的重复性。利用该方法对采集的临床样品进行检测,检测结果与RT-q PCR检测结果具有100%的符合率。说明real-time RT-RPA方法具有简单、快速、特异性强的优点,是一种潜在的FMDV快速检测方法。

利用反转录环介导等温扩增技术检测麻疹病毒

目的建立一种快速检测麻疹病毒的方法。方法以分离到的麻疹病毒RNA为模板，利用环介导等温扩增技术（LAMP）原理，设计合成3套引物，特异型识别病毒基因的8个位点，在反转录酶作用下，63℃扩增60min，80℃2min终止反应，最终产物分别经凝胶电泳和荧光目视观察。通过real—time仪实时监测反应过程，同时将该方法的灵敏度、特异度与常规RT-PCR、real-timeRT-PCR进行比较。结果RT-LAMP反应约1h即可完成，最终产物经电泳观察可见大小片段不等的呈梯度的扩增条带，目视显示反应液颜色由黄色变为绿色。灵敏性是常规RT-PCR和real—timeRT-PCR的100倍。结论RT-LAMP方法具有灵敏、特异、快速、简便、成本低等特点，适用于基层和现场使用。

染料法实时荧光聚合酶链反应检测人外周血αβT淋巴细胞克隆的条件优化及初步应用

目的 探讨实时荧光PCR检测人外周血αβT淋巴细胞克隆性扩增的反应条件及在监测慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者外周血克隆特异性T淋巴细胞上的初步应用.方法 染料法（SYBR Green Ⅰ）实时荧光PCR对6例健康献血者外周血单个核细胞（PBMC）来源的T淋巴细胞受体β链可变区（TCRBV）基因进行扩增,分别就退火温度、引物浓度、循环数等进行比较研究.优化后PCR检测12例慢乙肝患者PBMC来源的TCRBV的24个基因家族,作PCR产物的熔解曲线峰形图,并分析T淋巴细胞克隆性扩增情况.结果 染料法实时荧光PCR检测 TCRBV基因家族的最佳退火温度为60.6℃,引物终浓度为0.5 μmol/L,循环数为40个,且熔解曲线分析起始温度80℃优于75℃.PCR产物熔解曲线峰形图上发现,慢乙肝患者某些TCRBV基因家族表现为单峰,测序结果表明其为单克隆PCR产物.结论 本研究优化了染料法实时荧光PCR检测TCRBV基因家族方法,熔解曲线峰形图可用于检测人外周血T淋巴细胞的克隆性扩增,并可能用于检测慢乙肝患者外周血克隆特异性T淋巴细胞.

柑橘衰退病毒RT-RPA-LFD可视化检测方法的建立及应用

【目的】柑橘衰退病由柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)引起,是一种世界性的重要柑橘病害。为实现CTV的田间快速检测,建立一种准确、快速且可视化的检测方法。【方法】以CTV外壳蛋白(CP)的保守区域为靶标,设计3对特异性引物和探针,通过引物筛选,以及优化引物浓度、反应时间和反应温度等条件,建立CTV的反转录-重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RT-RPA-LFD)快速检测方法,明确其灵敏度,并用于田间疑似样品的检测。【结果】建立了CTV的RT-RPA-LFD检测方法:最佳检测引物为RPA-1F/R,对应探针为RPA-P,最佳反应条件为40℃,25 min,且与其他5种柑橘病毒无交叉反应。该方法的灵敏度是RT-PCR的100倍,最低可检测到2.12×10^(1)拷贝·μL^(-1)的CTV核酸,与RT-qPCR相当。采用RT-RPA-LFD法在67份田间样品中检测出CTV阳性样品41份,与RT-PCR法检测结果一致。【结论】建立的CTV RT-RPA-LFD法具有操作简单、快速、结果可视等优点,适合基层植保工作者对田间样品开展快速检测。