检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因组全序列,选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4进行复合套式PCR,建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段,与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT-nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明,有15份类似CDV强毒,5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT-nPCR可以有效检测CDV感染,能够将强、弱毒株区分开,可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。

集在线荧光分析的连续流动反转录-聚合酶链式反应快速扩增检测食源致病性轮状病毒

采用含RNA反转录(Reverse transcription,RT)和在线荧光分析的连续流动聚合酶链式反应(Poly-merase chain reaction,PCR)微流控技术检测食源致病性轮状病毒。此RT-PCR微流控装置以加热铜块组成恒温带,以聚四氟乙烯毛细管微通道为反应体系构建而成。采用循环水冷却退火区,此装置能获得低至31℃的退火温度,而且温度控制及其稳定性良好,因而能满足不同PCR的要求。为了充分体现PCR微流控技术的优越性,在线荧光分析被用于检测PCR产物。当流速为7.5 mm/s时,轮状病毒RNA的cDNA扩增和在线荧光分析能在约12 min完成(扩增约10 min,在线分析约2 min)。在此集成化的RT-PCR微流控装置上,1 h可完成轮状病毒RNA的RT-PCR以及其扩增产物的在线荧光分析,样品检出限达到6.4×104 copies/μL。

反转录-聚合酶链式反应检测结直肠癌二氢嘧啶脱氢酶的意义

目的研究结直肠癌患者二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的表达及其临床意义。方法结直肠癌患者42例,于FOLFOX6方案化疗前,取癌组织及癌旁正常组织,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测DPD的表达,观察其与毒性和预后的关系。结果癌旁正常组织DPD的表达高于相应癌组织(P<0.01)。结直肠癌组织DPD的表达状况和各种化疗反应无明显相关性(P>0.05)。正常组织DPD水平和口腔黏膜炎、腹泻的发生呈负相关(P<0.05)。Ⅲ期结直肠癌DPD高表达组和DPD低表达组患者的平均和中位无进展生存期(PFS)分别为28.3个月、27个月和38.6个月、36个月,差异无统计学意义(P>0.05)。结论结直肠癌组织DPD的表达可以预测Ⅲ期结直肠癌患者的预后,而癌旁正常组织DPD的表达可以预测5-FU相关毒性的发生情况。

反转录聚合酶链式反应定量分析巨噬细胞炎症蛋白-2 mRNA

目的:建立反转录聚合酶链式反应定量分析巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)mRNA的方法。方法:以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照,通过优化RT-PCR条件定量MIP-2 mRNA的表达。结果:获取了PCR线性扩增范围,确定了RT-PCR的最佳循环次数和模板量。结论:优化的RT-PCR方法可以用于MIP-2 mRNA的分析。

应用反转录-聚合酶链式反应对LH/CG受体在大鼠垂体中表达的研究

促黄体激素/绒毛膜促性腺激素(LH/CG)受体存在于睾丸和卵巢组织中.然而以往的研究都未报道有关LH/CG受体是否存在于垂体这一重要的内分泌腺体组织中.本研究利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),以大鼠垂体总RNA为模板,扩增LH/CG受体cDNA片段.结果表明:LH/CG受体cDNA不仅存在于卵巢组织中,同样也存在于垂体组织中,垂体组织LH/CG受体cDNA与卵巢组织受体cDNA类似,都是由外显子拼接而成,结果又表明:LH/CG受体cDNA在垂体组织中以较小分子结构(或同工型)形式存在.尽管在大鼠垂体组织中没有发现全长cDNA存在,但本研究提示我们:LH/CG受体分子在垂体组织中的形式可能是由一些不完整的cDNA片段表达而成,并且表达水平较低.

逆转录-套式PCR检测汉坦病毒感染的实验研究

目的:探讨逆转录-套式聚合酶链反应(RT-nested-PCR)检测汉坦病毒(Hantavirus,HV)感染的准确性和敏感性。方法:用RT-nested-PCR和直接免疫荧光法(direct immunofluorescence,FA)分别检测深圳市2005年肾综合征出血热宿主动物监测中捕获的鼠类中HV的感染情况。结果:在76份特异性总抗体阳性的鼠肺标本中,用RT-nested-PCR检出61份抗原阳性,而FA仅检出47份阳性。结论:RT-nested-PCR是一种比较准确的检测汉坦病毒感染的方法,其敏感性高于FA。

套式反转录PCR检测水中肠道病毒

依据文献报道的多种肠道病毒的核酸序列，设计合成了可用于多种肠道病毒检测的肠道病毒通用引物（外侧引物），以及可同时检测脊髓灰质炎（简称脊灰）病毒（Ⅰ～Ⅲ型）的特异性引物（内侧引物）。将两者结合起来可进行脊灰病毒的套式ＰＣＲ检验，既可检测多种肠道病毒，又可区分测定出脊灰病毒。此外对实验方法进行了改进，使操作方法更趋简单，中间可能污染的环节较少，结果稳定。与常规反转录ＰＣＲ比特异性强、敏感性高（可检测出只含１个ｐｆｕ病毒的水样）。

新型反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗方法的建立

对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计1对通用引物,扩增片段为609bp,并在该对引物扩增区域内设计针对疫苗弱毒的特异引物,扩增片段为237bp,建立一种能够区分猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的敏感、特异、重复性好的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别诊断方法。该方法能将我国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来,且不与牛病毒性腹泻病毒及其他猪源病毒发生非特异反应。应用本试验建立的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法可以及早对猪瘟作出准确诊断,并可将强毒感染猪迅速从弱毒疫苗免疫猪群中筛选出来,减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。

乙脑病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法 根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT nestedPCR ,将PCR产物进行了克隆测序;同时对猪细小病毒(PPV)、猴空泡病毒4 0 (SV4 0 )及正常乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞提取核酸进行PCR ,并对2 10份临床样品进行了检测。结果 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞均扩增出10 15bp和6 2 2bp目的基因片段,而PPV、SV4 0及未感染JEV的乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞均未见特异性扩增条带,2 10份猪组织样品中未检出阳性样品。RT nestedPCR检测的最低限度为10PFU病毒。从样品核酸的提取到PCR扩增及检测结果的报告可在8小时内完成。结论 本研究建立的RT NestedPCR方法具有快速、特异、敏感、可靠的特点,可用于人用猪源性生物制品中外源性JEV的污染检测。

基于巢式反转录-聚合酶链式反应技术检测葡萄病毒A和葡萄病毒B

皱木复合病在世界范围内普遍发生,是引起葡萄木质部畸形的一类病害的统称,在沙地葡萄、Kober5BB和LN33品种上表现茎痘、茎沟和栓皮等症状,其中葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)与Kober5BB品种上出现茎沟症状有关,而葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)与LN33品种上出现栓皮症状有关。

Caspase-3和核转录因子-κB在APPSWE转基因小鼠海马内的表达

目的探讨阿尔茨海默病（AD）的发生、发展与神经细胞凋亡之间的规律,以及核转录因子κB（NF-κB）在神经细胞凋亡中的调节作用,为阿尔茨海默病的发病机理和临床治疗提供依据。方法分别取P0、P7、P14、P30、P90、P180日龄的APPSWE转基因小鼠为模型组,各日龄同窝生野生型小鼠为对照组,应用Nissl染色观察其海马结构和锥体细胞形态,免疫组织化学方法检测小鼠海马细胞内半胱天冬氨酸蛋白3（Caspase-3）表达及NF-κB激活情况,RT-PCR检测小鼠海马caspase-3 mRNA的表达。结果模型组及对照组小鼠海马CA3区锥体细胞中凋亡细胞密度和NF-κB阳性细胞密度均随日龄的增大而逐渐下降,在P30后趋于稳定;与对照组相比,模型组凋亡细胞密度和NF-κB阳性细胞密度均增高,自P14以后具有统计学意义（P〈0.01或P〈0.05）;RT-PCR检测小鼠海马caspase-3 mRNA表达结果与Caspase-3免疫组织化学检测结果基本吻合。结论凋亡相关基因caspase-3和NF-κB在阿尔茨海默病的发病机理中起重要作用,NF-κB的激活可能促进神经细胞凋亡。

表没食子儿茶素-3-没食子酸酯抑制小鼠皮肤外伤愈合组织基质金属蛋白酶1的表达

目的探讨50 mg/L表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)对小鼠皮肤外伤愈合组织基质金属蛋白酶1(MMP-1)mRNA表达及MMP-1水平的影响。方法将57只小鼠随机分为对照组(含无损伤组和损伤对照组)、50 mg/L EGCG处理组和辅料组,除无损伤组为3只外,其余各组均为18只,然后分别于损伤后6、12、24、72、120、168 h取损伤愈合皮肤。利用RT-PCR和酶联免疫吸附法(ELISA)检测皮肤外伤愈合期间损伤愈合组织MMP-1 mRNA表达水平和MMP-1含量。结果检测结果表明,50 mg/L EGCG能在皮肤外伤愈合晚期(72 h后)抑制损伤愈合组织MMP-1 mRNA表达,降低MMP-1含量。结论 EGCG对皮肤外伤愈合、晚期愈合组织MMP-1mRNA表达和MMP-1生成具有抑制作用,提示50 mg/L的EGCG能促进皮肤外伤愈合。

转反义Trxs基因小麦灌浆期内源Trxh基因表达及淀粉酶活性的研究

为了进一步揭示反义Trxs基因在抗穗发芽小麦中的作用机理,以转反义Trxs基因的T4代转基因株系（以豫麦70为受体）为材料,运用RT-PCR检测和酶活性测定方法,对其灌浆过程中硫氧还蛋白h（Trxh）基因在不同水平上的表达方式以及α-淀粉酶活性进行了检测。结果表明,转基因小麦籽粒中内源Trxh基因mRNA转录量、Trxh硫氧还蛋白h活性和α-淀粉酶活性均显著低于未转基因的,平均分别比未转基因籽粒下降了21.1%,23.2%和12.6%。其中,花后25-30 d抑制作用最大。回归分析表明,Trxh基因表达量与Trxh活性、α-淀粉酶活性均呈极显著或显著正相关。说明反义Trxs基因的导入干扰或部分抑制了小麦内源同源基因的表达,致使Trxh表达量减少,Trxh活性降低,从而导致了α-淀粉酶活性的降低。

小反刍兽疫病毒RT-nPCR检测方法的建立

为了建立一种适用于临床快速诊断的小反刍兽疫病毒(PPRV)RT-nPCR检测方法,试验依据GenBank公开的PPRV基因序列,针对F基因设计了2对引物,经过反应成分与条件的优化等方法对检测小反刍兽疫病毒的RT-nPCR方法进行了研究。结果表明:该方法检测的极限为4.362×10^-5 ng·μL^-1,羊口疮病毒、山羊痘病毒、口蹄疫病毒和蓝舌病病毒检测为阴性,临床28份样品检测结果有4份样品为阳性,阳性率14.3%。说明成功建立了一种高度特异、灵敏的检测PPRV的RT-nPCR方法。

淀粉样前体蛋白β位分解酶1与β-淀粉样蛋白在糖尿病大鼠脑组织中的表达及行为学相关性

目的观察糖尿病大鼠脑组织淀粉样前体蛋白β位分解酶1(BACE1)、β-淀粉样蛋白(Aβ)的表达,探讨糖尿病糖代谢异常在阿尔茨海默病中的作用机制。方法腹腔注射链脲佐菌素诱发糖尿病大鼠动物模型,随机分为正常组(N组)、假手术组(S组)、4周模型组(M4组)、6周模型组(M6组)、8周模型组(M8组)。穿梭箱实验、Morris水迷宫实验检测大鼠认知行为学改变,免疫组织化学法、免疫印迹法、RT-PCR和酶联免疫吸附法(ELISA)检测BACE1;ELISA法检测Aβ在糖尿病大鼠脑组织中的表达,用图像分析仪测定吸光度值。结果M组大鼠的电击次数、学习和记忆潜伏期时间显著延长(P<0.01),主动逃避次数显著降低(P<0.01);ELISA法检测Aβ1-40和Aβ1-42显示糖尿病模型鼠脑组织内Aβ1-40水平明显增高,从正常组的(64.13±6.76)pg/mg升至模型组的(86.43±7.03)pg/mg(P<0.001);Aβ1-42也明显升高,从正常组的(67.43±5.12)pg/mg升至(89.45±5.28)pg/mg(P<0.001);糖尿病模型鼠脑组织内BACE1水平显著增高,ELISA法从正常组的(116.46±8.10)pg/mg升至模型组的(158.73±6.24)pg/mg(P<0.001)。免疫印迹法吸光度值从正常组的0.61±0.11升至模型组的1.52±0.16(P<0.001),RT-PCR法吸光度值从正常组的1.62±0.26升至模型组的3.61±0.32(P<0.001),免疫组织化学法吸光度值从正常组的0.81±0.21升至模型组的2.01±0.36(P<0.001)。BACE1和Aβ表达水平与学习和记忆负相关。结论BACE1和Aβ在糖尿病大鼠脑组织表达增高,糖尿病糖代谢异常增强BACE1和Aβ表达,参与了阿尔茨海默病的发病机制。

蛋白磷酸酶-2A催化亚基C在小鼠不同器官中的分化表达与定位

目的探讨蛋白磷酸酶-2A(PP-2A)的催化亚基(PP-2Ac)在6只小白鼠不同器官中的表达模式与定位。方法运用RT-PCR、免疫印迹法及免疫荧光技术等实验手段,分别从mRNA水平、蛋白和组织水平进行研究。结果在mRNA水平上,PP-2Ac在大脑中表达最高,卵巢中表达次之,而肌肉、肾脏、脾脏、心脏、肝脏、肺及乳腺中表达相对较低,胃中表达最低;在蛋白水平上,也是大脑中的表达最高,卵巢、脾脏、心脏、肝脏和肺中表达水平相对较高,肌肉、肾脏、乳腺中表达相对较低,胃中表达最低。免疫荧光结果显示,PP-2Ac的表达具有一定的组织特异性和细胞特异性。结论 PP-2A是哺乳动物体内最重要的蛋白磷酸酶之一。

L-苹果酸对大鼠转运蛋白及抗氧化酶基因表达的影响

对12月龄SD大鼠给予L-苹果酸30d后,采用含有SYBR Green I的Real Time RT-PCR法,对肝脏和心脏线粒体苹果酸天冬氨酸穿梭中的两种转运蛋白(天冬氨酸谷氨酸转运蛋白(AGC)与α-酮戊二酸苹果酸转运蛋白(OMC))以及两种抗氧化酶(过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px))的基因表达进行检测,以研究L-苹果酸增强线粒体抗氧化作用的分子生物学机制。结果表明:苹果酸组中大鼠心肌细胞AGC、OMC、CAT、GSH-Px的mRNA表达量分别是空白对照组的1.25、1.39、1.12、1.01倍。苹果酸组中大鼠肝脏细胞AGC、OMC、CAT、GSH-Px的mRNA表达量分别是空白对照组的1.33、1.02、1.25、0.94倍。由此推测,L-苹果酸可能通过促进苹果酸天冬氨酸穿梭蛋白以及抗氧化酶的基因表达,实现提高线粒体的抗氧化作用。