逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒

建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2+)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55℃,c(Mg2+)为2 mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38 CCID50.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中.

逆转录-多重巢式聚合酶链反应技术在骨髓增殖性疾病PDGFRB基因重排检测中的应用

本研究旨在探讨逆转录-多重巢式PCR技术在骨髓增殖性疾病(MPD)PDGFRB基因重排检测中的应用价值。利用逆转录-多重巢式PCR技术对146例MPD患者骨髓或外周血标本进行与PDGFRB基因重排相关的融合基因定性检测。结果显示,146例MPD患者骨髓或外周血标本中有8例出现PDGFRB基因重排,阳性率为5.5%。其中3例为TEL-PDGFRB融合基因,2例为HIP1-PDGFRB融合基因,1例为GIT2-PDGFRB融合基因,1例为TP53BP1-PDGFRB融合基因,1例为WDR48-PDGFRB融合基因。结论:运用逆转录-多重巢式PCR方法进行MPD患者PDGFRB基因重排检测,对于疾病诊断有一定指导意义,且可以为药物靶向治疗提供理论依据。

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。

反转录酶在微小RNA实时荧光定量聚合酶链反应中的作用

目的以微小RNA(miRNA)作为检测样本,考察影响实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结果的关键点,并筛选出最优的检测方法。方法采用3种miRNA提取方法(分别使用EasyPure^(■)miRNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒、TransZol Up Plus RNA提取试剂盒)和3种反转录方法(分别使用TransScript^(■)第一链cDNA反转录试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、miRNA第一链cDNA合成试剂盒)处理大鼠纹状体脑区,检测miRNA与c DNA的质量和效率,并使用常规RT-qPCR检测miRNA水平,比较不同方法所得结果。结果3种RNA提取方法得到的miRNA质量和效率比较差异均有统计学意义,其中方法2的效果较好,但方法1、2、3的RT-qPCR结果比较差异无统计学意义(miR-132:25.91±9.79、25.26±10.25、27.28±7.39,miR-U6:27.98±11.25、25.98±9.78、29.62±9.65,均P>0.05);3种反转录方法所得实验结果比较差异有统计学意义,方法3所得结果明显低于方法1、方法2(miR-132:16.53±3.17比35.20±1.06、31.42±2.95,miR-U6:16.63±1.73比36.06±2.57、35.59±1.54,均P<0.05),主要影响RT-qPCR的扩增效率和扩增特异性。结论使用能高效富集约18 nt大小RNA的提取方法和在miRNA的3’末端加多聚A尾(Poly A)的反转录酶,可以得到更可靠的RT-qPCR结果。

逆转录-聚合酶链反应在乙型脑炎诊断中的建立

目的 运用逆转录 -半套式 -聚合酶链反应技术 (RT -semi-nested -PCR) ,建立一种新的早期快速检测乙型脑炎病毒的方法。方法 收集临床诊断的 37例乙脑和 15例非乙脑病人标本 (包括血清、脑脊液 )分别为 6 3份和 30份 ,同时用RT -semi-nested -PCR、IgM捕获法ELISA(MacELISA)进行检测。 结果 血清和脑脊液中可成功检测出JEVRNA ,经1 5 %凝胶电泳 ,出现特异性条带 ,符合预计值 4 0 0bp。结论 RT -semi-nested -PCR对检测JEV感染 ,从实验设计到实验条件 ,都是合理的 ,有较高的敏感性和特异性。可用于乙脑的早期诊断。

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因组全序列,选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4进行复合套式PCR,建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段,与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT-nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明,有15份类似CDV强毒,5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT-nPCR可以有效检测CDV感染,能够将强、弱毒株区分开,可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。

用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的:建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果:定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log(X)+25.99和Y=-3.409log(X)+24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论:用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。

实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究

目的 探讨优化实验反应条件 ,使实时逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果。方法 建立质粒标准品作为外参照 ;以管家基因GAPDH作为内参照 ,并对Mg2 + 、引物与探针比例、Buffer等进行优化。结果 优化条件后 ,RT PCR反应的扩增效率接近了理论最佳值 ,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致 ,保证了方法的稳定性和可靠性。结论 为了获得可靠、重复性好的实时RT PCR绝对定量结果 ,应对实验方法进行优化。

用逆转录-聚合酶链反应检测乳腺癌患者骨髓微转移30例报道

目的 :通过分子生物学技术检测乳腺癌患者的微转移灶。方法 :患者常规行乳癌根治术 ,在完成皮瓣游离后 ,于胸骨柄处行骨穿 ,吸取骨髓 3～ 4ml,所采骨髓行RT -PCR检测其细胞角蛋白 19(KT19)含量。切除标本常规送病理。结果 :30例患者临床病理汇报同侧腋窝淋巴结转移阳性 17例 ,胸骨骨髓KT19阳性 7性 ,占4 1.12 % ,其中 3例肿块直径≥ 5 .0cm ,位于内乳内 ,临床未触及锁骨上淋巴结肿大 ;同侧腋窝淋巴结转移阴性13例 ,胸骨骨髓KT19阳性 3例 ,占 2 3.0 7%。总阳性率 33.33%。结论 :在术中游离皮瓣后于胸骨柄处进行骨穿获取骨髓 ,并转应用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)检测细胞角蛋白 19(KT19)在胸骨骨髓中的表达 ,可以早期诊断乳腺癌的微转移。

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

集在线荧光分析的连续流动反转录-聚合酶链式反应快速扩增检测食源致病性轮状病毒

采用含RNA反转录(Reverse transcription,RT)和在线荧光分析的连续流动聚合酶链式反应(Poly-merase chain reaction,PCR)微流控技术检测食源致病性轮状病毒。此RT-PCR微流控装置以加热铜块组成恒温带,以聚四氟乙烯毛细管微通道为反应体系构建而成。采用循环水冷却退火区,此装置能获得低至31℃的退火温度,而且温度控制及其稳定性良好,因而能满足不同PCR的要求。为了充分体现PCR微流控技术的优越性,在线荧光分析被用于检测PCR产物。当流速为7.5 mm/s时,轮状病毒RNA的cDNA扩增和在线荧光分析能在约12 min完成(扩增约10 min,在线分析约2 min)。在此集成化的RT-PCR微流控装置上,1 h可完成轮状病毒RNA的RT-PCR以及其扩增产物的在线荧光分析,样品检出限达到6.4×104 copies/μL。

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型多重反转录-聚合酶链反应的建立及初步应用

本文旨在建立一种快速、高效的检测肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)的方法,用于儿童手足口病的病原学监测。通过设计肠道病毒通用引物和CA16、EV71的型特异性引物,建立以不同引物浓度配比及两阶段退火温度提高检测敏感度和特异度的多重反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并对首都儿科研究所附属儿童医院2010年3～10月收集的371例手足口病患儿381份临床标本同时进行病毒分离和核酸检测。结果显示,本研究建立的多重RT-PCR方法对CA16和EV71的最低模板检测浓度分别为5.32pg/ml和0.64pg/ml,反应特异度为100%。应用该方法检测381份手足口病临床标本的总阳性率为77.4%,其中CA16与EV71的检测阳性率分别为31.8%和35.4%,两者检测阳性比为1∶1.1。以病毒分离为标准,多重RT-PCR对CA16及EV71检测的准确率分别为95.2%和98.6%。因此,本研究新建立的多重RT-PCR方法准确、简便,适用于较大量样本的手足口病病原学监测。2010年引起北京地区儿童手足口病的主要病原为CA16和EV71。

逆转录-聚合酶链反应诊断IBDV的免疫后感染

用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)对 5个养鸡场的 13份病死鸡腔上囊、腺胃标本进行了检测 ,诊断为免疫后感染传染性腔上囊病毒 (IBDV) 。

反转录-聚合酶链反应在呼吸道合胞病毒感染检测的应用

为呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）感染的临床诊断寻求敏感、特异的检测方法。采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增病毒培养液和急性呼吸道感染患者鼻咽分泌物中的ＲＳＶ基因，并应用地高辛标记ｃＤＮＡ探针对扩增产物进行鉴定。结果成功地提取了ＲＳＶｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经扩增得到４７１ｂｐ左右ｃＤＮＡ区带。流感病毒Ｂ、副流感病毒２型、腺病毒７型对照无扩增带。ＲＳＶ培养液１０倍连续稀释至１∶１０００，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增仍可见４７１ｂｐｃＤＮＡ区带。１３例患者鼻咽分泌物中的ＲＳＶ基因得到扩增，并经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹与斑点杂交证实。建立了ＲＳＶＲＴ－ＰＣＲ的方法，特异性、敏感性均较好，在临床标本的检测中将会有重要应用。

用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型毒株的基因序列设计了一对特异性引物P1/P2,扩增的片段为550bp,根据欧洲型毒株设计了一对特异性检测引物P3/P4,扩增的片段为433bp,建立PRRSV的RT-PCR的检测与血清型鉴别方法。特异性试验表明,这2对引物均不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的RNA或DNA。敏感性试验表明,这2对引物可以分别到检测10-5TCID50和10-4TCID50的病毒含量。利用该方法对重庆、四川某些猪场中临床上疑似为PRRS的20份送检组织样品进行检测,只有引物P1/P2能扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物;其中有15份样品呈PRRSV阳性结果,阳性率为75%,说明送检的样品感染的PRRSV为美洲型。试验结果表明该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的,是临床上对PRRS进行快速诊断和分子流行病学调查的实用方法。

实时定量反转录聚合酶链反应检测患儿急性粒细胞性白血病1-ETO融合基因的临床意义

目的分析实时定量RT-PCR在检测急性粒细胞性白血病（AML）1-ETO融合基因阳性AML微小残留病中的临床意义。方法对2000年1月-2007年1月收治的32例AML1-ETO阳性AML患儿进行实时定量RT-PCR检测。诱导化疗结束后及在巩固化疗阶段每1.5-2.0个月行AML1-ETO融合基因定量检测。使用Kaplan-Meier法分析不同融合基因水平患儿生存率。采用SPSS10.0软件进行统计学分析。结果共32例患儿进行诱导化疗,其中29例（90.625%）达到形态学完全缓解,3例形态学未缓解后放弃。达到分子生物学缓解患儿有更高的无瘤生存率（P=0.0018）。AML1-ETO高拷贝数组生存率低于低拷贝数组（P=0.1080）。诱导缓解化疗结束后AML1-ETO定量结果示〉10^-3组生存率低于定量〈10^-3组生存率（P=0.0230）。化疗6个月时AML1-ETO定量结果示〉10^-3组生存率高于定量〈10^-3组生存率（P=0.0001）。巩固化疗结束时AML1-ETO定量〉10^-5组生存率低于定量〈10^-5组生存率（P=0.0049）。结论定量评估AML1-ETO阳性的小儿AML微小残留病十分重要,有可能对治疗方案的选择提供重要信息。

聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线技术在下呼吸道细菌鉴定中的应用

为探讨聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线(PCR-HRM)技术在检测呼吸道菌群中的应用,本研究用支气管镜从慢性阻塞性肺病患者下呼吸道采集分泌液,提取细菌总DNA,以16S通用引物27F/1492R扩增16S rDNA全长,PCR产物经电泳、纯化后连接到pGEMT-Easy载体上,构建16SrDNA克隆文库。然后以16S rDNA V3区通用引物338F/518R扩增克隆文库,V3区PCR-HRM分析在罗氏LightCycler 480实时荧光定量PCR系统中进行,采用HRM基因扫描软件分析数据。根据不同HRM图型,挑选克隆株测序并鉴定菌株。结果显示,PCR-HRM技术可灵敏区分下呼吸道不同细菌16SrDNA V3区,根据HRM图谱可极大减少克隆菌株测序样本,提示PCR-HRM技术可作为一种快速、高通量、敏感、经济的菌群多样性检测方法。

逆转录聚合酶链反应检测鼻息肉环氧合酶-2mRNA表达

目的检测研究环氧合酶-2(cyclooxygenase-,COX-2)mRNA在鼻息肉组织中的表达水平,深入认识鼻息肉炎性发病机制。方法利用逆转录-聚合链反应(RT-PCR反应)检测35例鼻息肉组织及23例下鼻甲标本的环氧合酶-2的表达。结果鼻息肉组织中COX-2mRNA表达明显高于下鼻甲正常黏膜。结论鼻息肉组织中COX-2表达明显增高,鼻息肉发病过程中有前列腺素参与。

用反转录-聚合酶链反应检测狐狸感染犬瘟热病毒的研究

应用反转录——聚合酶链反应技术成功地从发病银黑狐的脾脏中扩增出一条特异性的核酸带,为狐狸犬瘟热病的诊断提供了一个特异敏感的方法。