应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性

目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术反转录成cDNA,根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增,通过熔解曲线测定不同的熔解温度(Tm)和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液(斑)的Tm值为(84.5±0.2)℃,片段长度177 bp;唾液(斑)的Tm值为(76.9±0.3)℃,片段长度134 bp;精液(斑)的Tm值为(88.5±0.2)℃,片段长度294 bp。结论与常规检验法比较,联合应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠,可应用于日常法医物证检验。

新城疫强毒特异性反转录荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种敏感性高、特异性强、成本更低的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)特异性反转录荧光定量PCR(reverse transcription fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法,基于对所有已知NDVF基因序列特征的分析,设计了一对强毒特异性引物,以体外转录制备的RNA标准品为阳性模板,构建了标准曲线,并对该方法的敏感性、特异性和准确性进行了验证。结果表明,基于SYBRGreenⅠ嵌合荧光技术建立的检测方法能够特异性扩增NDV强毒,最低可检测1拷贝/μL的RNA,用于临床毒株的检测结果与序列测定一致,可作为适合大规模监测NDV强毒的方法和工具。

猫杯状病毒实时荧光定量逆转录PCR检测方法的建立

为了建立可快速检测猫杯状病毒(FCV)的方法,本试验采用肽核酸(PNA)设计分子信标荧光探针,优化反应体系和条件,建立了FCV实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测方法,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证,并进行临床样本检测。结果显示,建立的RT-qPCR检测FCV参考株具有良好的线性关系(R^(2)=0.9995),最低检测限为1×10^(2)TCID_(50)/mL,对其他相关病毒无有效响应,组内变异系数和组间变异系数均小于1%。应用该方法检测33份临床样本,阳性率为51.5%。由此可见,本试验建立的RT-qPCR敏感性、特异性和重复性均良好,可为FCV的早期快速诊断和疫病防控等提供检测手段。

实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价

为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性,本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA≥100 IU/mL 81例、HBV DNA<100 IU/mL 76例,以及作为对照的非HBV感染患者55例。采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中,SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)。2种方法具有较好的相关性与一致性(R 2=0.803和CCC=0.882)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1 log copies/mL,相对偏倚为0.97%。配对t检验显示,结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者血清样本中,HBV RNA阳性检出率不同,SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为88.16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R 2=0.326和CCC=0.438)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.5 log copies/mL,相对偏倚为0.86%。配对t检验显示,结果有统计学差异(t=3.654,P<0.001)。在非HBV感染对照患者中,SAT和qRT-PCR均未检出HBV RNA阳性。结果提示,在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中应用SAT与qRT-PCR检测血清HBV RNA,其相关性与一致性较好,在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者中相关性与一致性存在一定差异。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

荧光定量反转录PCR检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平

目的运用荧光定量反转录PCR技术,检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平。方法以基因型为(αα/αα)的新生儿作为正常对照组,基因型为(--/αα)的新生儿为病例组。选择β肌动蛋白基因为校正基因,ζ珠蛋白基因为目的基因。运用双标准曲线法检测两组新生儿脐血的ζ珠蛋白mRNA的转录水平。结果病例组的ζ珠蛋白mRNA的平均转录水平明显增高。结论通过荧光定量反转录PCR技术能够检测出基因型为(--SEA/αα)的新生儿的ζ珠蛋白mRNA转录水平的增高,具有较好的诊断价值。

反转录荧光定量聚合酶链反应联合检测hMAM和BCL-2在乳腺癌诊断中的应用

目的研究反转录荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(BCL-2)和乳腺癌人乳腺珠蛋白(hMAM)基因在外周血循环肿瘤细胞(CTCs)中的表达水平,探讨BCL-2和hMAM 2种乳腺癌相关基因联合检测在乳腺癌诊断中的临床应用价值。方法采用RT-qPCR法,并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内对照检测健康对照组(55例)、乳腺癌组(171例)和良性乳腺疾病组(91例)外周血CTCs中BCL-2和hMAM的表达水平。结果外周血CTCs中BCL-2和hMAM在健康对照组和良性乳腺疾病组表达水平差异无统计学意义(P>0.05),乳腺癌组表达水平高于健康对照组、良性乳腺疾病组,差异有统计学意义(P<0.05)。hMAM和BCL-2联合检测灵敏度显著高于单一基因。结论联合检测外周血CTCs中hMAM和BCL-2基因表达水平可提高乳腺癌诊断的灵敏度,有效辅助临床诊断乳腺癌。

人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测

目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定量测定人 β 肌动蛋白 (hBA)的mRNA作为内对照。用梯度稀释的克隆的人 β 肌动蛋白基因制作标准曲线。结果 :标准曲线的相关系数为 1.0 0。实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为 7.1%。HepG2细胞hTERTmRNA与hBAmRNA的比值为 (1.3± 0 .3)× 10 -4。结论 :建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。

苏太猪肌内脂肪沉积相关基因SRC-1的差异显示反转录PCR鉴定

采取90头180日龄去势苏太猪的背最长肌组织测定肌内脂肪含量,从中选取肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)的最高和最低各6头组成RNA池,采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)鉴定两组间差异表达的基因,结果共获得14条表达序列标签(expressed sequence tags),即EST序列,通过GenBank比对发现其中3条为已知序列。为进一步验证这3个已知基因与肌内脂肪之间的关系,从90个个体中选取肌内脂肪最高和最低各15个个体进行实时定量PCR检测。结果表明,细胞核受体共激活因子1基因(SRC-1)mRNA表达水平与肌内脂肪含量存在负相关关系(r=-0.38,P<0.05)。提示:SRC-1蛋白有可能参与了肌内脂肪沉积的调节。

中华根瘤菌NP1中反硝化基因启动子分析及荧光定量PCR验证

目前,在污水脱氮过程中N_2O的释放量逐年上升,造成温室效应,引起酸雨并破坏臭氧层。为了研究在反硝化过程中N_2O释放的机制,利用生物信息学软件在线预测了中华根瘤菌NP1反硝化过程中4个关键酶基因的启动子信息。经预测,反硝化过程所需的4个关键酶基因的表达并非传统观念上认为的使用同一个启动子,而是4个不同的启动子。同时还发现,硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的启动子转录活性较强,而一氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶的启动子则转录活性较弱。为进一步探究上述预测结果,我们利用荧光定量PCR检测中华根瘤菌NP1中以KNO_3为唯一氮源培养时,反硝化4个关键酶基因转录水平上的差异,以及测量反硝化过程中产生的代谢产物含量。发现硝酸盐还原酶基因和亚硝酸盐还原酶基因的转录水平明显高于一氧化氮还原酶基因和氧化亚氮还原酶基因,在反硝化过程中确实有一定量的N_2O气体积累,推测可能与不同启动子的强弱有关。因此,可通过改造操纵子等基因工程手段调节反硝化关键酶的表达,使N_2O全部还原为N_2后再释放到空气中,构建更加高效绿色的污水脱氮菌株,具有深远的社会意义。

实时逆转录聚合酶链反应定量检测人TNF-α mRNA的表达

目的建立一种快速、灵敏、特异定量检测人外周血单个核细胞(PBMC)表达 TNF-α mRNA 的方法。方法根据 Gene Bank 中 TNF-α mRNA 序列和 MGB 探针荧光定量分析原理,设计合成特异的引物和探针,优化实验条件,建立定量检测人 TNF-α mRNA 的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并对10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后进行 TNF-α表达检测。结果本法灵敏度为10~3拷贝/毫升、线性检测范围达6个数量级(10~3～10~9拷贝/毫升);特异性好,PCR 产物电泳后无非特异性条带产生,非目的扩增产物用本法进行检测,均无荧光信号响应;以 Ct 值计算变异系数(CV 值),批内批间 CV值均小于5%;10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后 TNF-α mRNA 的平均含量分别为10^(4.15±0.49)和10^(5.19±0.43)拷贝/毫升。结论Taqman-MGB 实时荧光 RT-PCR 定量检测人 TNF-α mRNA 表达水平,结果快速、准确、特异、灵敏,具有临床推广价值。

荧光定量RT-PCR检测人组织因子mRNA

目的 建立检测组织因子 (tissuefactor ,TF)mRNA荧光定量的方法 ,了解组织中TF的表达水平 ,研究TFmRNA的表达与肿瘤的关系。方法 构建克隆载体 pUC TF作为定量模板 ,在GeneAmp 5 70 0型检测仪上定量检测 4 2例不同恶性程度胶质瘤组织标本 ,5例正常脑组织标本和人恶性胶质瘤细胞株U 2 5 1。结果 4 2例肿瘤组织均有mRNA的表达 ,范围从 3 .6× 10 5～ 8.8× 10 7拷贝 / μgRNA ,均值为 2 .9× 10 6 拷贝 / μgRNA ,且拷贝数与恶性程度成正比 ;5例正常脑组织中 ,1例检测不出 ,其他 4例的强度为 3 .8× 10 3～ 5 .1× 10 4拷贝 / μgRNA ,均值为 6.2× 10 3拷贝 / μgRNA ;胶质瘤细胞株U 2 5 1的强度为 2 .8× 10 6 拷贝 / μgRNA。 结论 成功地建立了荧光定量检测TF基因表达方法 ,检测结果可用绝对拷贝数表示 ,定量准确可靠。

荧光定量PCR用于hTRIMCyPA抑制HIV-1的研究

目的:建立相对荧光定量PCR测定HIV-1晚期反转录产物方法,并以其评价hTRIMCyPA对HIV-1的抑制作用。方法:选择HIV-1的LTR区和HIV-1Gag之间的序列设计晚期反转录产物引物,以GAPDH基因为内参基因,建立SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR测定HIV-1晚期反转录产物的体系,并用来评价hTRIMCyPA重组蛋白对HIV-1晚期反转录产物的影响。结果:在建立的荧光定量PCR体系中,晚期反转录产物和内参GAPDH标准曲线的斜率分别为-3.381、-3.289。相关系数R 2分别为0.9929、0.9937,均>0.99,表明二者的线性较好,晚期反转录产物基因及参照基因GAPDH基因扩增效率相同,可用于相对定量分析。hTRIMCyPA表达组HIV-1相对晚期反转录产物量明显少于空载体组。结论:本研究建立的定量HIV-1特异性反转录产物相对荧光定量PCR检测方法简单、高效和成本低廉,并且hTRIMCyPA对HIV-1反转录具有明显抑制作用。

荧光定量PCR检测山羊褪黑素受体表达体系的优化研究

本研究通过系统对比试验,优化建立了检测山羊卵巢组织中褪黑素受体基因表达量差异的荧光定量PCR技术体系,在这种体系下检测褪黑素受体1A基因在山羊卵巢组织中的差异表达量,可以得到最优的标准曲线,使起始模板浓度与循环数有良好的线性关系,且扩增效率百分数Eff接近1;荧光动力学曲线符合标准的"S"形荧光增长曲线,曲线拐点清楚,基线平而无明显上扬趋势;熔解曲线成单峰,充分说明扩增的特异性高,产物单一,与SYBR Green I荧光染料结合的为目标DNA片段,荧光曲线能够准确反映目的产物的扩增结果。

齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立

【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因序列分析其序列保守区,使用Primer Premier 5.0设计反转录荧光定量PCR引物及TaqMan荧光探针,建立检测齿兰环斑病毒的一步法RT-qPCR。构建齿兰环斑病毒cp基因克隆质粒,并以该质粒作为标准品进行荧光定量PCR标准曲线测定;以齿兰环斑病毒、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的病毒RNA为模板进行一步法RT-qPCR特异性检测;以10倍倍比稀释的cp基因质粒为模板进行灵敏性检测;用该法对大田18个兰花样品进行齿兰环斑病毒感染情况监测。【结果】齿兰环斑病毒一步法RT-qPCR检测法仅检出齿兰环斑病毒阳性模板,其余模板检测结果为阴性,说明检测方法具有特异性;该方法能够检测到的齿兰环斑病毒cp基因最低拷贝数为130;大田兰花样品感染齿兰环斑病毒的检出率为100%。【结论】一步法RT-qPCR是一种特异性强、灵敏度高,且适合监测实际生产过程中兰花感染齿兰环斑病毒情况的检测方法。

端粒酶逆转录酶启动子热点突变的ARMS-LNA-qPCR检测方法建立

目的建立一种定量检测端粒酶逆转录酶(TERT)启动子区-124bp(C/T)和-146bp(C/T)位点突变率的实时荧光定量PCR方法。方法以常规PCR扩增含有TERT热点突变位点的纯化产物作为检测标本,采用等位基因扩增阻滞原理(ARMS)的引物,并结合锁核酸(LNA)探针作为野生等位基因抑制子,建立实时荧光定量PCR的TERT启动子热点突变率检测方法(ARMS-LNA-qPCR)。在30例表观健康人确定检测下限。结果所建方法的突变率标准曲线为:-124bp(C/T)突变率%=10(0.262×ΔCt+4.325)(P<0.001,R2=0.999),-146bp(C/T)突变率%=10(0.261×△Ct+3.895)(P<0.001,R2=0.999)。在表观健康人中所确定的-124bp和-146bp检测下限分别是0.07%和0.05%。结论所建ARMS-LNA-qPCR的TERT热点突变检测方法具有定量检测突变率并适合临床常规开展的优势。采用普通PCR纯化产物作为检测标本,使得所建方法具有检测各种类型标本的普适性。

樱桃病毒A实时荧光定量PCR检测技术的建立与应用

在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物,经特异性筛选后,获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品,建立标准曲线,同时验证该方法的灵敏度和特异性,并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特异性强的引物(CVA-dF2、CVA-dR2),基于SYBR Green I荧光染料建立反转录实时荧光定量PCR检测CVA的方法。该方法重复性好、灵敏度高,无需借助内参基因即可准确检测目的病毒载量,绝对定量标准曲线斜率为-3.5746,决定系数R2为0.9986,扩增效率为0.9044,比常规RT-PCR检测灵敏度高10倍。该方法的建立为CVA定量研究提供了有力工具,可用于果树中CVA批量检测或低丰度病毒样品检测。

阉割对猪甲状腺转录因子-1、2(TTF-1,2)基因表达的影响

为了研究阉割对甲状腺转录因子-1、2(TTF-1,2)基因的影响,本研究采用荧光定量PCR技术分析阉割与非阉割金华猪甲状腺组织中TTF-1和TTF-2基因在60、90和120日龄时的表达水平。结果表明:非阉割猪TTF-1和TTF-2基因在不同生长阶段的表达量呈稳步上升趋势,阉割猪TTF-1和TTF-2基因的表达基本稳定。TTF-1与TTF-2mRNA的表达量均是在60、90日龄时阉割组高于非阉割组;在120日龄时,阉割组TTF-1与TTF-2mRNA的表达量均低于非阉割组,但差异不显著(P>0.05)。结果,建立的SYBR-Green荧光定量PCR方法可以有效地用于TTF-1和TTF-2基因的表达分析;另外,阉割使得猪甲状腺TTF-1和TTF-2基因在60、90日龄的表达量升高,且TTF-1基因的表达与猪部分肉质性状存在显著的相关性。

毛竹LTR反转录转座子PHRE8的鉴定与转录模式分析

LTR反转录转座子是植物基因组中重要的组成部分,可作为遗传工具在生物学研究上发挥重要作用。为探究毛竹中具有潜在活性的LTR反转录转座子,解析LTR反转录转座子转座激活机制,本研究从毛竹基因组中克隆1条典型的LTR反转录转座子序列,命名为PHRE8,系统地分析了PHRE8的结构特征、插入特性和进化关系,并利用荧光定量PCR检测PHRE8在DNA甲基化抑制剂(5-氮杂胞苷)、辐射、高温、低温、高盐逆境胁迫下的转录水平。结果表明,PHRE8属于Ty3-gypsy超家族,全长5296 bp,具有完整的GAG与POL结构域,插入时间约为123.07万年,是具有理论潜在活性的转座子;在不同胁迫处理下,与野生实生苗相比,PHRE8的相对表达量均有所增加,猜测PHRE8在不同胁迫条件下,会激发其转录活性,影响宿主基因组结构和基因表达模式的变化,以适应外界环境改变。本研究结果为进一步探究毛竹基因组中活性转座子的功能奠定了一定的理论基础。

马A3Z3V1抑制马传染性贫血病毒早晚期反转录的鉴定

马A3Z3V1是宿主细胞内的一种APOBEC3免疫因子,它可以有效抑制马传染性贫血病毒(EIAV)在马宿主细胞内的复制。为鉴定马A3Z3V1分子对EIAV早晚期反转录的抑制作用,本实验根据EIAV的R/U5和gag基因序列分别设计了检测EIAV早晚期反转录产物的引物并建立了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,利用该方法评价免疫因子A3Z3V1对EIAV逆转录过程的影响。结果显示,在早期反转录过程中,A3Z3V1可以使EIAV的反转录产物最高减少7倍;在晚期反转录过程中,A3Z3V1可以使EIAV的反转录产物最高减少3倍。本实验结果将有助于进一步研究APOBEC3分子的抗病毒作用机制。