双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)快速检测基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)快速检测方法。结果显示:该方法在40℃恒温孵育25 min即可完成靶序列扩增;特异性强,和猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均无交叉反应;灵敏度高,最低检出限为2×10^(0)TCID_(50)/μL,是常规RT-PCR方法的10倍;应用该方法对39份疑似PRRSV感染的临床样品进行检测,检出阳性样品25份,和实验室前期建立的荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。以上结果说明,本研究建立的RT-RAA检测方法简便快速、特异性强、灵敏度高、临床适用性好,为PRRSV感染的快速诊断提供了新的技术手段。

实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价

为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性,本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA≥100 IU/mL 81例、HBV DNA<100 IU/mL 76例,以及作为对照的非HBV感染患者55例。采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中,SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)。2种方法具有较好的相关性与一致性(R 2=0.803和CCC=0.882)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1 log copies/mL,相对偏倚为0.97%。配对t检验显示,结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者血清样本中,HBV RNA阳性检出率不同,SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为88.16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R 2=0.326和CCC=0.438)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.5 log copies/mL,相对偏倚为0.86%。配对t检验显示,结果有统计学差异(t=3.654,P<0.001)。在非HBV感染对照患者中,SAT和qRT-PCR均未检出HBV RNA阳性。结果提示,在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中应用SAT与qRT-PCR检测血清HBV RNA,其相关性与一致性较好,在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者中相关性与一致性存在一定差异。

基于逆转录重组酶聚合酶扩增技术的苹果病毒新型快速检测方法

利用逆转录重组酶聚合酶扩增技术(Reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA),为苹果病毒的快速检测提供技术支持。以苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)和苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)为检测对象,通过特异性RPA引物设计以及反应条件优化,对检测方法的灵敏度、特异性进行评价,并与传统RT-PCR方法进行比较。结果表明,所设计的RPA引物特异性高,反应温度为37℃,反应时间为20 min,RT-RPA对4种苹果病毒的检测灵敏度为9.63×10^(1) copies,是普通RT-PCR的10^(2)~10^(3)倍。所建立的RT-RPA检测方法具有等温反应、检测速度快、灵敏度高等优点,可以用于快速检测苹果病毒病。

重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。

用重组酶介导等温核酸扩增技术检测烟曲霉

目的建立检测烟曲霉的重组酶介导等温核酸扩增技术（RPA）方法。方法筛选针对烟曲霉ITS1-2靶DNA序列的特异性引物。建立RPA快速检测烟曲霉方法并进行条件优化。分析RPA特异性和敏感性并与Taq PCR结果进行比较。结果RPA检测烟曲霉的优化条件为：引物长度：18-30 bp;产物长度：200-700 bp;扩增温度：37-42℃,最低在27℃也可实现扩增;扩增时间：15-40 min,15 min即可达到凝胶电泳可检测的产物量;只需简单的恒温加热设备。RPA和Taq PCR可检测到的最低DNA浓度均为100 ng/m L。RPA仅对烟曲霉有特异性扩增,对黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、中国红酵母均无交叉扩增反应。结论建立的针对烟曲霉ITS1-ITS2靶DNA序列的RPA检测方法,可以快速、特异、灵敏地鉴定和检测烟曲霉。

环介导等温扩增技术在SARS-CoV-2核酸检测中的应用研究

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的高度传染性导致全球SARS-CoV-2感染病例迅速增加。寻找一种较传统实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术更加准确、快速的检测方法对疾病确诊及疫情防控尤为重要。环介导等温扩增技术(LAMP)与反转录酶相结合(RT-LAMP)已成功应用于SARS与中东呼吸综合征的检测,在SARS-CoV-2检测中亦表现出潜在优势。该文对SARS-CoV-2的结构特点、人类感染机制、LAMP的检测原理及其在SARS-CoV-2检测中的应用研究进展进行详细综述,以期为临床提供一种较RT-PCR更加快速、特异且具有明显成本-效益的SARS-CoV-2核酸检测方法。

环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒

【目的】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究拟用该技术建立菊花中番茄不孕病毒(TAV)的检测方法。【方法】设计能识别TAV CP序列6个特定区域的4种LAMP特异引物,对MgCl2、dNTPs、甜菜碱等LAMP反应条件进行优化,利用新建的LAMP法检测TAV,比较LAMP和RT-PCR2种不同方法的检测灵敏度。【结果】建立了检测番茄不孕病毒的LAMP技术;LAMP比RT-PCR具有灵敏度更高、快速、简便等优点。【结论】建立的LAMP技术能快速、准确、简便地检测出菊花中的番茄不孕病毒。

逆转录环介导等温扩增技术

逆转录环介导等温扩增技术（Reverse Transcription Loop,Mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP）是一种新颖的RNA扩增方法。其基本原理是采用4到6条特异引物（针对基因的6到8个区域）及一种具有链置换活性的DNA聚合酶和AMV反转录酶．

环介导等温扩增技术检测建兰花叶病毒

为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到LAMP检测快速检测方法。所建立的检测方法比RT-PCR更灵敏;且具有特异性,操作简单,不需要复杂的仪器,肉眼可直接观察检测结果。适合基层和现场检测。

基于ORF7基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RAA检测方法的建立

根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)copies/μL;与PRVBartha-K61、PCV、CSFV、PRRSVGD、PRRSVXH-GD、PRRSVGM2、PRRSVCH-1a病毒均无交叉反应。分别对157份样品进行荧光RT-RAA法与PCR方法的检测进行比对,结果显示,荧光RT-RAA法敏感性为94.0%,特异性为100%。建立的PRRSV荧光RT-RAA法操作简便,特异性强,灵敏度高。

NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计引物、crRNA,经优化反应条件后,建立了NoV GⅡ.2亚型RTRPA-CRISPR/Cas12a检测方法。结果显示:利用引物NoV-GⅡ.2-F1B和NoV-GⅡ.2-R1对NoV GⅡ.2标准RNA进行RT-RPA扩增,结合crRNA1介导的CRISPR/Cas12a报告体系,能在40 min内完成NoV GⅡ.2核酸检测;该方法检测灵敏度为10 copies/μL,且与轮状病毒、腺病毒、星形病毒、人副肠孤病毒、博卡病毒和札如病毒无交叉反应;应用该方法和qRT-PCR法,分别对30份临床模拟样本进行检测,发现总符合率达96.67%。结果表明,本研究建立的NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法无需依赖昂贵设备,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷快速等特点,为NoV GⅡ.2感染的现场检测和防控提供了新方法。

基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立

[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。

鳗鲡疱疹病毒基础RPA及RPA-LFD检测方法的比较

【目的】鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)是鳗鲡“脱黏败血综合征”的主要病原,对鳗鲡养殖产业造成了严重的经济损失。为达到早期预警和防止病毒扩增蔓延的目的,建立一套AngHV快速检测技术对中国鳗鲡养殖疾病防控具有重要意义。【方法】本研究根据AngHV ORF55设计了扩增引物和探针,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)的基础RPA及RPA侧向流层析试纸条法(RPA-LFD)检测方法,探究了不同时间和温度对基础RPA和RPA-LFD扩增效果的影响,并比较了2种方法的灵敏度、特异性和临床应用效果。【结果】本研究建立的AngHV基础RPA及RPA-LFD快速检测方法扩增产物大小为394 bp;2种检测方法都仅需20~40 min即可完成检测过程;温度的变化对检测方法的影响不大,37~43℃范围内均能得到较好的扩增效果;2种检测方法均与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)和鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus)无交叉反应,表现出良好的特异性;RPA-LFD检测方法具有更高的检测灵敏度,检出限至1.32×10^(0)copies/mL,基础RPA检出限至1.32×10^(3)copies/mL;检测实验室保存的20份鳗鲡病料DNA,2种方法检测的结果一致,阳性率均为30%,表明AngHV基础RPA和RPALFD检测方法均具有良好的临床应用潜力。【结论】AngHV基础RPA和RPA-LFD检测方法十分适用于基层科研单位、鳗鲡产品加工场及养殖场的病毒检测,丰富了AngHV检测手段的可选性。

基于RT-RAPID和CRISPR-Cas12a的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高且简单方便的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法,下载诺如病毒GⅡ.6基因组序列,用Mega7.0对基因组进行比对分析获得高度保守序列;基于保守序列设计诺如病毒GⅡ.6的反转录重组酶和聚合酶等温检测(RT-RAPID)技术扩增引物、荧光探针、crRNA和报告分子;优化RT-RAPID的反应引物、反应温度和反应时间及Cas12a检测用的crRNA,并分析RT-RAPID-Cas12a方法的特异性和灵敏度。基于RT-RAPID荧光法和RT-RAPID-Cas12a荧光法的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸快速检测方法能在1 h内完成检测并得出结果,灵敏度分别为10 copies/μL和0.5 copies/μL,且两个方法均与诺如病毒GⅡ.17型、鼻病毒、偏肺病毒和博卡病毒无交叉反应。2个检测方法与RT-qPCR阳性样本一致率均为90%,阴性样本一致率均为100%。论文建立的基于RT-RAPID和Cas12a的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法均可高效快速地检测出诺如病毒GⅡ.6,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷且快速等特点。

双重荧光RT-ERA技术快速检测贝类食品中诺如病毒

目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别将GI、GII NoV参考靶序列克隆到带有T7启动子的载体中,通过体外转录的方式获得高纯度NoV RNA参考样品。以设计的MS2噬菌体引物探针,与实验室前期筛选的GI、GII NoV引物探针进行双重荧光RT-ERA实验,并对反应体系和反应程序进行优化,分析方法的灵敏度。最后,采用建立的方法开展真实样本检测,以GB 4789.42-2016《食品微生物学检验诺如病毒检验》为参比方法进行检测结果对比,确定方法的准确性和可行性。结果:建立MS2与GI、MS2与GII两组双重荧光RT-ERA检测方法,最佳引物及探针体积分别为4.1μL与1.8μL,检测时间可缩短至10 min左右,且最低可检出102拷贝/μL的NoV核酸样品。应用所建立的方法对29份真实样品进行检测,检测结果与GB 4789.42-2016一致。结论:本研究建立的双重荧光RT-ERA检测方法可实现对MS2、GI和GII NoV的同时检测,且灵敏度高、准确性强,为今后NoV现场快速检测提供一定基础。

柑橘衰退病毒RT-RPA-LFD可视化检测方法的建立及应用

【目的】柑橘衰退病由柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)引起,是一种世界性的重要柑橘病害。为实现CTV的田间快速检测,建立一种准确、快速且可视化的检测方法。【方法】以CTV外壳蛋白(CP)的保守区域为靶标,设计3对特异性引物和探针,通过引物筛选,以及优化引物浓度、反应时间和反应温度等条件,建立CTV的反转录-重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RT-RPA-LFD)快速检测方法,明确其灵敏度,并用于田间疑似样品的检测。【结果】建立了CTV的RT-RPA-LFD检测方法:最佳检测引物为RPA-1F/R,对应探针为RPA-P,最佳反应条件为40℃,25 min,且与其他5种柑橘病毒无交叉反应。该方法的灵敏度是RT-PCR的100倍,最低可检测到2.12×10^(1)拷贝·μL^(-1)的CTV核酸,与RT-qPCR相当。采用RT-RPA-LFD法在67份田间样品中检测出CTV阳性样品41份,与RT-PCR法检测结果一致。【结论】建立的CTV RT-RPA-LFD法具有操作简单、快速、结果可视等优点,适合基层植保工作者对田间样品开展快速检测。

寨卡病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立

目的建立1种适用于现场的快速、高效实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)检测寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)的方法。方法利用ZIKV膜蛋白基因保守序列设计特异性引物及探针,构建膜蛋白基因重组质粒并作为参考品,建立ZIKV的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)检测方法,并与实时荧光定量RT-PCR法进行灵敏度比较。利用建立的方法对三带喙库蚊进行模拟添加ZIKV检测。结果成功构建ZIKV膜蛋白重组阳性质粒,与ZIKV核苷酸同源性为100%。建立的RT-RPA法扩增产物起飞时间与质粒拷贝数标准曲线为y=-1.0319x+15.146,R^(2)为0.9947,最低检出限为2.91 copies/μL,高于荧光定量PCR法(29.1 copies/μL),检测时间为30 min。结论建立的ZIKV RT-RPA检测方法,简便、灵敏、特异性强,反应快速,适用于ZIKV现场应急、基层实验室或出入境口岸的快速检测。

利用反转录环介导等温扩增技术检测麻疹病毒

目的建立一种快速检测麻疹病毒的方法。方法以分离到的麻疹病毒RNA为模板，利用环介导等温扩增技术（LAMP）原理，设计合成3套引物，特异型识别病毒基因的8个位点，在反转录酶作用下，63℃扩增60min，80℃2min终止反应，最终产物分别经凝胶电泳和荧光目视观察。通过real—time仪实时监测反应过程，同时将该方法的灵敏度、特异度与常规RT-PCR、real-timeRT-PCR进行比较。结果RT-LAMP反应约1h即可完成，最终产物经电泳观察可见大小片段不等的呈梯度的扩增条带，目视显示反应液颜色由黄色变为绿色。灵敏性是常规RT-PCR和real—timeRT-PCR的100倍。结论RT-LAMP方法具有灵敏、特异、快速、简便、成本低等特点，适用于基层和现场使用。

柑橘衰退病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立一种反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermalamplification,RT-LAMP)检测柑橘衰退病毒(Ctrus tristeza virus,CTV)的一步法检测技术。【方法】根据CTV保守的p25设计2对特异性引物,对RT-LAMP体系的最佳反应条件、特异性、灵敏度等进行研究。【结果】建立了一种特异性检测CTV的RT-LAMP方法,该方法的灵敏度比RT-PCR方法高100倍,产物通过Acc I酶切得到验证,而且反应产物中加入SYBR Green I可直接观察样品是否感染CTV。【结论】RT-LAMP法检测CTV,其成本低、准确且快速,可满足基层、科研单位等对该病害检测的需要。