鼠尾静脉流体力学转染技术对绿色荧光蛋白表达质粒器官靶向分布的影响

目的:观察流体力学尾静脉注射对绿色荧光蛋白基因器官靶向性的影响,为今后质粒载体的基因治疗和功能研究寻找潜在的靶器官。方法:实验于2005-12/2006-04在江西省分子医学重点实验室完成。选用健康雄性昆明鼠40只,将32只小鼠按随机数字表法分为流体力学注射和常规注射两大组,每大组再分为转染组和对照组两个小组(n=8),并设正常对照组(n=8)。①流体力学转染组将100μg/只绿色荧光蛋白表达质粒溶液2mL在5s内快速注入尾静脉;对照组仅在5s内注入林格氏液2mL。②常规注射组则将2mL林格氏液或绿色荧光蛋白表达质粒溶液在30s左右注入尾静脉。注射结束后24h采集各组小鼠血清检测转氨酶,并采集肝、脾、心、肾、肺和脑组织进行冰冻切片,部分肝组织采用多聚甲醛固定后切片,荧光显微镜下观察。结果:40只小鼠全部进入结果分析,无脱失。①流体力学注射组和常规注射组小鼠血清转氨酶与正常对照组比较差异均无显著性意义(P>0.05)。②常规尾静脉注射引起少数肾小球细胞表达绿色荧光蛋白,而肝、脾、心、肺及脑等组织未见明显绿色荧光蛋白表达。③流体力学注射引起肝内绿色荧光蛋白高水平表达,肝细胞表达率接近45%,其他组织则无绿色荧光蛋白表达。结论:流体力学方法是肝靶向性的活体基因转染方法,绿色荧光蛋白可作为该方法进行目的基因研究的一个可靠和方便的示踪剂。

肿瘤荧光示踪研究新进展——荧光蛋白示踪在肿瘤研究中的应用

荧光示踪细胞的方法有2种：一种是荧光染料给细胞染色，如CM．DiI、BrdU、DAPI、Hochest等。染料能直接标记细胞，但是对于增殖细胞来讲，因染料不是基因依赖，不能遗传给子细胞，因此随着细胞增殖，被标记的细胞会越来越少，只能用于短时间观察。另一种是通过载体转染荧光素酶／蛋白基因到目的细胞，

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的能力

目的:研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymastemcells,MSCs)体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力,为血管组织工程在体研究提供实验依据。方法:实验于2003-10/2004-10在第三军医大学基础部解剖学教研室完成。无菌条件下采集绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓,用直接贴壁法获得小鼠MSCs,然后以血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)进行诱导分化,最后对扩增的细胞特征进行八因子(Willbrandfactor,vWF)免疫荧光鉴定观察。结果:MSCs每扩增一代,细胞数量增加4～8倍,7.0×103个原代MSCs体外扩增3代即获得1.4×108个细胞。在70%～80%融合时呈现“铺路石”样形态,说明绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增条件与一般小鼠相同。添加VEGF诱导2周后,以免疫荧光法检测细胞的vWF的表达发现,诱导组的vWF呈阳性表达,对照组vWF表达呈阴性。结论:绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增能力强,在VEGF作用下可以向内皮细胞转化。

5-脂氧酶/绿荧光蛋白转染评价PC12细胞损伤后5-脂氧酶核膜移位

目的:通过绿荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)/5-脂氧酶(5-lipoxygenase,5-LOX)稳定转染PC12细胞,以可视化方法观察5-LOX在不同损伤后的变化。方法:将带有5-LOX基因的pEGFP-C2质粒及pEGFP-C2质粒(对照),稳定转染至PC12细胞;在缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation,OGD)、H2O2和NMDA处理后,荧光显微镜下观察GFP/5-LOX在细胞内的定位;同时,以免疫细胞化学方法观察野生型5-LOX分布及其变化。结果:转染GFP/5-LOX的细胞内,GFP/5-LOX主要均匀表达于细胞核内;仅转染GFP的细胞GFP表达于胞核和胞浆。OGD和H2O2处理后,分别有50.6%和57.7%细胞的GFP/5-LOX移位到核膜;NMDA处理或仅转染GFP的细胞,未见核膜移位现象。野生型5-LOX分布在细胞核和细胞浆内,3种损伤处理均诱导核膜移位。结论:稳定转染GFP/5-LOX的PC12细胞,GFP/5-LOX主要分布在细胞核;不同损伤处理诱导的5-LOX核膜移位,有不同的特点。

生物发光示踪技术在胶质瘤研究中的进展

生物发光示踪技术是指通过不同生物学方法使需要观察的器官、组织、细胞及分子产生发射光，通过发射光检测设备可视化追踪靶目标的生理病理变化。胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤，虽然经过数十年的基础与临床研究，但胶质瘤的预后仍差强人意。其关键是对胶质瘤的发生、发展过程尚未完全阐明，最大的困难在于胶质瘤的发生是一个多因素驱动极其复杂的过程，

小鼠肌肉内绿色荧光蛋白基因电转染

目的 :将细胞电通透技术应用到 DNA肌肉转染并确定达到高效电转染的参数条件。方法 :以增强绿色荧光蛋白 (EGFP)基因质粒作为报告基因 ,进行小鼠体内肌肉组织电转染实验 ,在部分参数固定情况下 ,某一参数发生变化 ,通过荧光显微镜观察、公式计算得出转染率 ,进行比较。确定转染的最佳电场强度、脉冲时值和质粒剂量。结果 :EGFP质粒 15μg注射到小鼠的胫前肌 ,在注入后给予如下参数 ,即电脉冲 2 0 0 V· cm- 1 ,2 0 m s,1Hz,8次 ,转染率最高 ,可达 (73.2± 7.2 ) %。 EGFP质粒注射后不会在细胞外立即降解 ,注射质粒 DNA 1h内给予电脉冲不影响转染率 ;15μg为最适当的 DNA剂量 ;EGFP蛋白的表达 ,7d达到高峰。结论 :与单纯 EGFP质粒肌肉注射相比 ,DNA肌肉电转染可极大地提高其转染率。

蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定

目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白(GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究。方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a(+);在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性。结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性。结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究。

体内生物发光成像在肿瘤转移研究中的应用

体内生物发光成像(in vivobioluminescence imaging)在生物医学研究中是一个强有力的工具,能够非侵入性、定量及实时动态监测活体动物体内的生物学过程。一个完整的生物发光成像过程,包括构建荧光素酶(luciferase)报告基因,建立稳定表达荧光素酶的细胞,再将此细胞移植到动物体内,进而可以在体外通过敏感的光学检测系统检测到动物体内特定部位所发出的光。生物发光成像能够示踪特定细胞(肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞和细菌等)在体内的迁移,反映特定基因的时空特异性表达以及蛋白质间相互作用等。本文主要就生物发光成像的原理、特点及其在肿瘤转移相关研究中的应用作一概述。

以红色及绿色荧光蛋白为标记基因的血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2真核表达载体的构建及其在293-T细胞中的共表达(英文)

背景:血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白具有协同促进血管生成的作用。目的:构建在真核细胞中表达人血管内皮生长因子165的红色荧光蛋白表达载体和携带人骨形态发生蛋白2的绿色荧光蛋白表达载体,共转染真核细胞以研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在293-T细胞内的表达和定位。设计:随机对照实验。单位:解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室。材料:实验于2002-09/2004-03在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室完成。pCDNA3.1(+)/骨形态发生蛋白2由美国UCLA大学Dr.Bostrom惠赠;pDsRed1-N1由ProfessorRogerY.Tsien,UniversityofCalifornia,SanDiego,USA惠赠。pUC18/血管内皮细胞生长因子165,293-Tcells由本实验室保存。方法:根据已知的人血管内皮生长因子165序列,设计在目的片段两端分别携带酶切位点的两条引物,用聚合酶链反应从质粒pUC18/血管内皮生长因子165中扩增出去除终止密码子的人血管内皮生长因子165片段,定向克隆至含报告基因的质粒pDsRed1-N1中,构建重组质粒pDsVEGF165Red1-N1;同时,构建pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白表达载体。以DOTAP为介导,将重组质粒共转染293-T细胞,48h后用激光共聚焦显微镜检测报告基因红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白的表达,使用反转录聚合酶链反应及免疫印迹方法检测血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内表达。主要观察指标:质粒的酶切鉴定及重组质粒在293-T细胞中mRNA及蛋白水平的表达。结果:重组质粒经酶切、聚合酶链反应和DNA序列测定证明构建正确,目的基因在293-T细胞中在mRNA及蛋白水平获得表达。激光共聚焦显微镜观察到红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白在细胞内共定位的情况。结论:成功构建pDsVEGF165Red1-N1和pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白2种含报告基因的真核表达载体,两者共转染后能在真核细胞中表达,为研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内的相互作用提供了一个重要而方便的工具。

荧光蛋白示踪在肿瘤研究中的应用

研究表明，肿瘤干细胞能逃避各种治疗得以存活下来，并成为肿瘤复发的根源，其中一个非常重要的机制就是其拥有一个特殊的微环境。目前已知脑肿瘤干细胞和神经干细胞类似，其栖身场所同样是以微血管结构为主的微环境，故有人称之为血管巢。初步研究发现，血管巢由多种类型的细胞和胞外基质成分构成，细胞类型包括内皮细胞、周细胞、星形细胞、巨噬细胞和成纤维细胞等。

起搏通道HCN2基因和增强型绿色荧光蛋白双基因载体在人胚胎肾细胞的共转染表达

背景:获得高效、安全的基因转移载体是目前研究的目标。目的:构建携带起搏通道(HCN2)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双基因真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞(HEK293)表达情况。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2006-07/2007-08在全军重点实验室解放军总医院老年心血管病研究所完成。材料:质粒pIRES-EGFP为Clontech公司产品,PCI-HCN2质粒,含有人全长HCN2基因为解放军总医院老年心血管病研究所惠赠。方法:利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖进入位点(IRES),构建HCN2与增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体pIRES-EGFP-HCN2。将脂质体和pIRES-EGFP-HCN2基因混合后转染人胚胎肾细胞,用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达。主要观察指标:①重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2的构建。②起搏通道基因HCN2 cDNA的克隆。③增强型绿色荧光蛋白表达的荧光检测。结果:构建的pIRES-EGFP-HCN2在转染8h后开始表达,48h达到最高。经酶切鉴定含有增强型绿色荧光蛋白和HCN2基因。结论:实验成功地构建了pIRES-EGFP-HCN2真核共表达载体,具有HCN2、增强型绿色荧光蛋白的双重活性,IRES能够介导外源基因HCN2在人胚胎肾细胞表达。

共表达红光荧光蛋白及发夹RNA载体的构建及鉴定

目的 :构建共表达红光荧光蛋白及短发夹状 RNA的重组真核载体。方法 :利用亚克隆、T- A克隆和PCR技术构建 pc DNA3.0 / Ds Red- U6 - sh GFR及 pc DNA3.0 / Ds Red- U6重组载体。结果 :成功构建上述两种真核重组表达载体。结论 :这种共表达载体的构建为进一步利用 RNAi技术研究真核细胞基因功能奠定了基础。

红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究

目的研究红色荧光蛋白编码基因Dsred在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达。方法根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠PCR方法快速克隆获得全长Dsred基因,将其与pMD-18T载体连接后进行测序鉴定。通过In-fusion方法将鉴定正确的pMD-Dsred重组载体与酿酒酵母表达载体pYeDP60进行连接,测序后利用LiAc方法将鉴定正确的pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌W303-1B中,PCR扩增筛选阳性克隆,获得的W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌经诱导培养后进行SDS-PAGE电泳分析和绿光激发荧光成像检测。将工程菌分别接种至YPD、YPG、SCG和SCD培养基,培养48、72、96、120和144h后分别测定吸光度(A600)值。取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于–70、–20、4、28和37℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性。结果连续重叠PCR扩增和测序鉴定结果表明,扩增获得的Dsred基因长为678bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred基因已成功插入pYeDP60-Dsred重组表达载体,且受酵母诱导型启动子GAL10-CYC1调控表达。PCR扩增筛选和SDS-PAGE分析显示,pYeDP60-Dsred重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光。4种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别,重组Dsred红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长。荧光显微镜观察显示,工程菌经不同处理后,高渗组红色荧光蛋白成熟时间最短,菌液组时间最长;红色荧光蛋白在37℃条件下培养时成熟最早,但降解速度较快。结论成功构建了pYeDP60-Dsred重组酿酒酵母表达载体,实现了Dsred基因在酿酒酵母菌体内的异源表达。红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响,且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟。

生物发光

夏夜,在乡间小路上散步,你四周到处是亮光.萤火虫闪烁着,上下飞动,闪光的小虫从栖息的草丛中发出微弱的亮光,就在你脚下也会出现一团蘑菇发出的绿光.这些光都是由各种生物发出的.

脂质体介导色素上皮衍生因子-绿色荧光蛋白质粒转染大鼠视网膜细胞及其转染途径的实验研究

目的观察表达质粒色素上皮衍生因子（PEDF）-绿色荧光蛋白（GFP）以脂质体介导转染入BN大鼠视网膜组织的表达及定位，探索合适的基因治疗给药方法。方法将脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP分别经玻璃体注射和视网膜下注射的途径转染至BN大鼠眼内，于一定时间内分别用荧光显微镜观察GFP表达情况，用RT—PCR方法检测PEDF表达情况。结果（1）BN大鼠视网膜下注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后1d即可见在荧光显微镜下观察到在注射点周围明显的绿色荧光蛋白分布于视网膜全层包括RPE细胞层，第2、3周荧光强度比第1周增强，荧光范围也有所扩大，可以持续表达4周。RT—PCR结果证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。（2）经玻璃体腔注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后第1天BN大鼠的视网膜和RPE细胞亦可见绿色荧光蛋白表达，且分布更均匀，范围更广。第1、2周表达明显增强，到第4周仍有表达。RT—PCR结果也证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。结论阳离子脂质体可以成功介导PEDF—GFP基因转染至BN大鼠的视网膜组织、RPE细胞中，并能够持续表达。视网膜下注射和玻璃体腔注射均为有效的转染途径。本研究为视网膜，脉络膜新生血管性疾病的基因治疗奠定了基础。

上皮性卵巢癌血清中肿瘤标志物水平及其临床意义

目的:肿瘤标志物已广泛应用于临床。血清CA125检测是目前临床常用的上皮卵巢癌早期筛查和早期诊断方法之一,但使用单一特异性肿瘤标志物诊断上皮性卵巢癌比较困难。本研究采用肿瘤标志物组合检测法,比较各肿瘤标志物单独检测与联合检测在上皮性卵巢癌诊断中的价值。方法:收集上皮性卵巢癌患者(n=65)和卵巢良性疾病患者(n=29)的临床资料。采用多肿瘤标志物蛋白质芯片检测癌抗原125(cancer antigen 125,CA125)、糖类抗原242(carbohydrate antigen 242,CA242)、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、β-人绒毛膜促性腺激素(beta-human chorionic gonadotropin,β-HCG)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、癌抗原199(cancer antigen 199,CA1990)、神经元-特性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、铁蛋白(Ferritin)、癌抗原153(cancer antigen 153,CA153)以及人生长激素(human growth hormone,HGH)的血清水平,比较其在卵巢良恶性肿瘤中的差异;χ2检验分析肿瘤标志物与卵巢上皮癌患者临床病理特征的相关性;Spearman秩关性分析上皮性卵巢癌CA125与其他肿瘤标志物表达水平及年龄与上述10种肿瘤标志物的相关性;采用灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、约登指数及诊断效率分别评价各肿瘤标志物单项检测及联合检测的诊断价值。结果:上皮性卵巢癌组中的β-HCG、NSE、CA153和CA125水平均高于卵巢良性疾病组。上皮性卵巢癌患者血清中NSE的水平与患者的临床分期相关。此外,上皮性卵巢癌患者血清中CA242、β-HCG、CEA、NSE、Ferritin、CA153水平与CA125水平呈正相关(分别rs=0.497、P<0.001;rs=0.612、P<0.001;rs=0.358、P=0.003;rs=0.680、P<0.001;rs=0.322、P=0.009;rs=0.609、P<0.001),β-HCG、Ferritin、CA153水平与患者年龄呈正相关(分别rs=0.256、P=0.040;rs=0.325、P=0.008;rs=0.249、P=0.046)。在上皮性卵巢癌诊断中,CA125单独检测的灵敏度、约登指数及诊断效率均高于其他9种肿瘤标志物单独检测的结果;CA153、CA199、CA242、Ferritin、CEA与CA125进行联合检测时,其灵敏度均高于CA125单独检测的灵敏度,其中CA125+CEA、CA125+Ferritin+CEA这2种组合的灵敏度分别为89.2%和90.8%,诊断效率均为84.1%,高于其他组合的诊断效率。CA125+CEA联合检测时其约登指数为0.616,高于其他组合。结论:CA125在诊断上皮性卵巢癌方面具有较高的诊断价值。血清中的肿瘤标志物组合检测在上皮性卵巢癌中具有更高的灵敏度和特异度。

HBx-siRNA快速筛选体系的建立和应用

目的 :建立针对 HBx的小干扰 RNA(si RNA)快速筛选体系。方法 :1构建 HBx与增强型绿色荧光蛋白(EGFP) N端融合表达质粒 ;2用一步 PCR法 ,制备针对 HBx m RNA的 RNA多聚酶启动子 - si RNA表达框(SEC) ;3将 SEC转染 HBx- EGFP瞬时表达的 AD2 93细胞 ,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察分析 SEC对 HBx- EGFP荧光表达的抑制效果 ,从而确定有效 si RNA。结果 :1成功构建 HBx- EGFP融合表达质粒 p HBx- EGFP,在瞬时表达细胞中 ,HBx- EGFP绿色荧光主要呈颗粒状 ,聚集在核膜与核膜外周或细胞浆 ;2共转染 SEC能有效抑制 HBx- EGFP的瞬时表达。与 si HBx2 71相比 ,si HBx388是一高效 si RNA位点 ,并且该位点与 t RNAVal和 H1启动子搭配更有效。结论 :成功建立表达 HBx的荧光蛋白报告体系 ,结合快速制备 SEC的方法 ,可用于进行 HBx有效 si

重组质粒pEGFP-N3-APC在结肠癌细胞株HT-29中的表达

【目的】构建含有APC蛋白功能区域的pEGFP-N3-APC重组质粒,转染结肠癌细胞HT-29,观察重组质粒的表达。【方法】设计引物分别扩增5条APC基因功能区域片段。将扩增片段与pEGFP-N3载体连接后挑取阳性克隆,行菌落PCR和测序鉴定。使用Lipofectamine 2000将重组质粒转染结肠癌细胞株HT-29,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达。【结果】构建5条带有APC不同结构域重组真核表达载体pEGFP-N3-APC,重组真核表达载体转染HT-29细胞后,可观察到绿色荧光蛋白的表达。【结论】真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC的成功构建,为进一步研究其在细胞内的功能提供了基础。

hTERT核心启动子驱动的条件复制型腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定一种新型人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的条件复制型腺病毒载体。方法采用PCR的方法克隆腺病毒E1区基因(E1A,E1B55K)、E1B的启动子(E1Bp)以及人端粒酶逆转录酶亚基启动子(hTERTp),以及2个目的基因:人GM-CSF和GFP(GreenFluorescenceProtein,GFP)。采用一系列分子生物学方法构建pShuttle-GFPSV55K穿梭质粒,应用此穿梭质粒与AdEasy-1腺病毒DNA在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒,将其转染293细胞获得Ad-GFPSV55K重组腺病毒。PCR法鉴定重组腺病毒,噬斑形成实验测病毒滴度。结果经过酶切鉴定成功地构建了分别携带GM-CSF基因和GFP报告基因的腺病毒载体,病毒滴度为7×1010pfu/ml。结论成功获得由hTERT启动子驱动的条件复制型腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗打下良好的基础。

重组人质粒pEGFP-人内皮一氧化氮合酶的构建

目的:构建含有增强绿色荧光蛋白报道基因的人内皮一氧化氮合酶重组质粒,为细胞转染提供实验依据。方法:实验于2005-05/10在首都医科大学宣武医院完成。用EcoRⅠ酶切pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒,获得人内皮一氧化氮合酶基因,设计引物进行聚合酶链反应扩增。将人内皮一氧化氮合酶与pMD18-Tsimple平滑载体连接后,行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,回收人内皮一氧化氮合酶,然后将其与经过酶切处理的含有增强绿色荧光蛋白报道基因的载体pEGFP-C1进行连接,形成8.4kb的质粒,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切进行电泳筛选、鉴定和测序。结果:①目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA的获得:pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒经EcoRⅠ酶切后,电泳可见3kb及3.7kb处各出现一条条带,与质粒图谱所示相符,证明质粒正确。加入上下游引物行聚合酶链反应扩增后,电泳可见3.7kb处出现一条条带,证明人内皮一氧化氮合酶cDNA的获取成功。②人内皮一氧化氮合酶cDNA的酶切处理:人内皮一氧化氮合酶与pMD18-Tsimple平滑载体连接后,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳分析可见3.7kb和2.7kb处各出现一条条带,证明两者连接成功。③pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的筛选:载体pEGFP-C1与人内皮一氧化氮合酶cDNA的连接后,EcoRⅠ单酶切电泳可见8.4kb处出现一条条带,再用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳可见4.7kb和3.7kb处各出现一条条带,证明连接正确。④pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的序列测定:序列测定结果与pEGFP-C1插入点序列及目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA两端序列对比相同,证明重组质粒构建成功。结论:pEGFP-人内皮一氧化氮合酶重组质粒的成功构建,可用于细胞转染,为人内皮一氧化氮合酶基因转移治疗在心血管疾病中的应用提供实验基础。