发光酶基因luxAB标记硅酸盐细菌NBT菌株的研究

外源基因标记技术为研究土壤引入细菌的生态行为提供了有效的检测手段 .通过选择不同的碳源和降低碳氮比筛选获得 0 2 5 %麦芽糖作为碳源的菌体制备培养基 .对硅酸盐细菌BT菌株进行紫外诱变和抗生素抗性驯化获得一株抗利福平 2 0 0 μg·ml-1的NBT R2 0 0菌株 ,含发光酶基因luxAB的质粒pTR10 2∷luxAB在辅助质粒 pRK2 0 13的帮助下转入该菌株中 ,从而赋予NBT菌株以发光活性和利福平、卡那霉素、四环素三种抗生素抗性 .以对数生长期的菌体制备受体细胞 ,发现对数生长前期的细胞转移频率最高 ,可达 6 70× 10 -5,杂交比例以 1∶1∶1适宜 .标记菌株RL85的释钾能力没有丧失且有提高 ,发光特性稳定 ,连续转接 2 0次后仍具有发光活性和 3种抗生素抗性 ,适用于根际微生态学研究 .

用发光酶基因(luxAB)标记法研究慢生花生根瘤菌的竞争结瘤能力

lux AB基因标记是一种新型基因标记技术 ,在很多研究领域都有着良好的应用前景。研究通过三亲本杂交将 lux AB基因成功地向慢生型花生根瘤菌进行了转移 ,并获得了一株带 Lux AB基因标记的菌株Cspr7- 1。对 Cspr7- 1进行性状、标记基因的遗传稳定性检测 ,结果表明 ,Lux AB基因不仅能有效表达 ,而且性状稳定。在无氮水培条件下进行标记菌株与土著根瘤菌的竞争结瘤试验。结果证实 ,Cspr7- 1在植物根系上的占瘤率平均达到 61 .3% ,比土著根瘤菌的竞争结瘤能力强 ,而且 Cspr7- 1在主根上的侵染能力远较侧根上的强 ,平均高出 2 2 .3%～ 39.6%。

青海弧菌Q67荧光素酶基因luxAB与luxCDABE在大肠杆菌中表达与发光特性比较

目的对比淡水发光细菌——青海弧菌Q67荧光素酶基因luxAB和luxCDABE在新的表达体系中的表达,为构建特异性检测毒性的重组菌提供基础。方法设计引物扩增得到青海弧菌Q67荧光素酶基因luxAB和luxCDABE,将其分别与表达载体pET-22b连接,转化大肠杆菌DH5α测序,阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。检测两种重组菌的发光特性及重金属离子对其毒性影响。结果通过测定重组菌的相对发光强度(RLU)和OD600值可知:luxAB和luxCDABE重组菌在癸醛和IPTG浓度均为1μL/mL培养基里培养第1小时后达到最大RLU,值分别为750618.5和140901.5。检测重金属离子Cd^(2+)、Hg^(2+)、Cr^(6+)对重组菌的毒性,EC_(50)(半有效浓度)值分别为:luxAB重组菌:5.160、5.129、7.097 mg/L;luxCDABE重组菌:6.137、7.643、7.736mg/L。结论在相同培养条件下,luxAB重组菌比luxCDABE重组菌获得了更大的RLU,说明lux AB表达效果更好。重金属对重组菌的毒性影响检测,luxAB重组菌得到了更低的EC_(50)值,进一步论证了这个观点。

应用发光酶基因对快生型大豆根瘤菌HN01结瘤作用进行检测

含发光酶基因luxAB的Tn5转座子自杀质粒pHNC3，在辅助质粒pRK2013的帮助下，转入快生型大豆根瘤菌HN01中小，pHNC3经自杀重组，其Tn5－luxAB转座插入HN01基因组中，从而赋予HN01以发光活性。挑取具有发光活性的HN01杂交单菌落，进行质粒快检和以luxAB为探针的分子杂交，选取Tn5-luxAB分别插入到HN01染色体上和不同质粒上的标记菌株，进行灭菌盆栽实验，并对一株Tn5-luxAB标记于染色体上的菌株HN01LC02进行了模拟大豆栽培条件下的有菌盆栽实验，包括对发光根瘤菌占瘤率的测定和发光根瘤在根系上分布情况的测定。

发光酶标记基因在微生物分子生态学研究中的应用

1 前言随着分子生物学向微生物生态学的渗透,微生物生态学的研究内容和水平正不断深化和提高,一门新的分支学科——微生物分子生态学也已日趋成熟[1]。对释放至环境中的遗传改良微生物(genetically modified microorganisms,简称GMMs)进行风险评估(risk assessment)、测量引入细菌在植物根部、叶面的定殖动态、容量或土壤中的群体数量则是微生物分子生态学的主要研究内容之一。但是,由于大多数细菌并不具有足以与同类土著细菌区分的特征而无法做到特异性的检测与回收。因此,通过遗传重组将外源基因(标记基因,marker gene)导入供试菌株,从而在检测或回收释放至土壤中的该种菌株时可以将其与同类土著细菌分开的方法(亦即标记基因技术)

发光酶基因标记的荧光假单胞菌Xl6L2在小麦根圈的定殖动态

在土壤微宇宙系统内及田间土壤中,采用发光酶基因标记检测技术研究了荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens,简称Pf)Xl6L2在小麦根圈的定殖动态。研究结果表明:在不灭菌灰潮土微宇宙中,Pf·Xl6L2在小麦播种后36d定殖密度可达最高水平(32×104cfu.g-1根),然后开始下降,最后保持在一个相对稳定的较低水平(约32×102cfu.g-1根))。在田间条件下,Pf·Xl6L2通过种子表面接种在小麦根圈的定殖动态与微宇宙中的相似,可散布至种子下方10cm以内,水平移动距离在植物播种后125d不超过40cm。

含发光酶基因的转座子质粒载体的改造及向根瘤菌HN01的转座

将从自杀性重组质粒pDB30上分离的3．6kb含卡那霉素抗性基因和发光酶基因（luxAB）的BglⅡ酶切片段，克隆到小Mr的高拷贝质粒pIJ2925上，构成新的质粒，pHNLX1011；然后将pHNLX1011经BglⅡ部分酶切，酶连在含蔗糖酶基因（sacB）的自杀性重组质粒载体pMH1701上，载体分别采用BglⅡ酶切和BamHⅠ酶切．连接转化后共得到4种重组质粒类型的菌株，它们具有不同发光活性；将它们分别与快生型大豆根瘤菌HN01进行三亲本杂交，发现它们的转座频率均较pDB30高．对经转座标记后的根瘤菌进行发光活性检测，只有pHNC3质粒所转座的根瘤菌浇具有较强发光活性．所得发光根瘤菌衍生菌株能在野大豆和栽培大豆黑农39根际形成正常根瘤，能用X光片记录下根瘤的发光活性．

小麦根圈荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的发光酶基因标记

采用２亲本杂交的方法将Ｔｎ５－ｌｕｘＡＢ标记基因系统成功地转入了分离自小麦根圈的ＰＧＰＲ菌株荧光假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｘｌ６菌株中。与亲本菌株相比，携有发光酶基因ｌｕｘＡＢ的标记菌株Ｘｌ６Ｌ２生理生化特征的变化很小，而且仍保留有在小麦根圈的定殖能力。Ｔｎ５－ｌｕｘＡＢ片段在Ｘｌ６Ｌ２中的稳定性很强，在没有卡那霉素选择压力的情况下，ｌｕｘＡＢ也能稳定表达。即使在４０℃温度下。

甲基对硫磷降解菌DLL-1的发光酶基因标记及在土壤中的变化

采用三亲接合法成功地将携带有发光酶基因的pTR1 0 2转入了甲基对硫磷降解菌Pseudomonassp .DLL -1菌株中。获得的接合子在液体培养、固体培养过程中以及在土壤中其标记质粒非常稳定。标记质粒并没有给受体细胞的生长、降解甲基对硫磷的能力带来严重的影响。因此 ,将标记菌株DLL -1-B用于土壤生态研究是可行的。在土壤中 ,DLL -1 -B的数量在接种后最初 2天下降幅度较小 ,随后下降速度较快 ,但当下降到 1 0 3～ 1 0 4 g- 1时趋于稳定。DLL -1 -B在水中下降速度更快 ,存活时间更短。DLL -1 -B在旱地土壤中的移动性较差 ,大多存在于 0～ 1 0cm土壤中。在水田中 ,DLL -1 -B的移动性较好 ,2周后 ,2 0～ 3 0cm土壤中测得DLL -1 -B为 2× 1 0 2 g- 1。

电化学发光-聚合酶链式反应方法检测胰腺癌中K-ras基因点突变

发展了一种可用于快速检测胰腺癌中K-ras癌基因点突变的电化学发光-聚合酶链式反应(ECL-PCR)分析方法。该法采用三联吡啶钌标记的上游引物和生物素标记的下游引物对目的片段进行PCR扩增;再采用限制性内切酶MvaI对扩增产物进行酶切。由于野生型样品和突变型样品间存在酶切位点的变化,其中只有野生型样品能被切断;通过生物素与链霉亲和素包被的磁珠连接,将生物素标记的DNA片段收集到检测池中,进行电化学发光检测。采用该法对13例胰腺癌组织中的K-ras癌基因第12位密码子进行点突变分析,只需要10μL样品、20min孵育时间和30s采集时间,就可得出其中有12例存在点突变,点突变率为92.3%。本方法操作简便、安全、快速、灵敏,可用于检测任何一种导致限制性内切酶位点改变的基因点突变。

利用发光酶基因标记技术跟踪棉花根圈中的绿针假单胞菌PL9L

采用细菌转化和杂交的方法，成功地将全套发光酶基因标记系统Ｔｎ７ｌｕｘＣＤＡＢＥ引入绿针假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）ＰＬ９，得到稳定的发光标记菌ＰＬ９Ｌ。采用发光菌落平板计数法和Ｘ射线胶片自显影法，通过盆栽试验和盒裁试验，研究了发光标记菌ＰＬ９Ｌ在棉花根圈的定殖动态和分布规律。盆栽试验结果表明，在灭菌土盆栽中，播种后６ｄ左右ＰＬ９Ｌ在棉花根圈的定殖水平达最高（３１×１０９ｃｆｕ／ｇ根土），播种后５６ｄ左右趋向稳定，ＰＬ９Ｌ数量为１７×１０２ｃｆｕ／ｇ根土；未灭菌土盆载中，播种后８ｄ左右ＰＬ９Ｌ的定殖水平达最高（１１×１０９ｃｆｕ／ｇ根土），４６ｄ左右趋向稳定，菌数为１４×１０２ｃｆｕ／ｇ根土。盒栽试验结果表明，ＰＬ９Ｌ可从种子向根尖方向扩散，但并不与根的伸长生长同步，播种后３６ｄ，灭菌土盒栽中ＰＬ９Ｌ可扩散至种子下方１２０ｃｍ以内，而未灭菌土盒栽中ＰＬ９Ｌ扩散至１１０ｃｍ以内。在棉花根尖区域均未检测到ＰＬ９Ｌ。

两株发光酶基因标记的重组大豆根瘤菌在土壤缩影中的存活研究

研究了发光酶基因 (luxAB)标记的重组费氏中华根瘤菌HN0 1DL、大豆慢生根瘤菌TA113QD与其出发菌株HN0 1、TA11在灭菌和未灭菌土缩影中的存活动态。结果表明 :HN0 1DL和TA113QD在灭菌土缩影和未灭菌土缩影中的存活动态特征显著不同 :标记菌株在灭菌土缩影中的早期存活数量一般有所下降后而保持相对稳定的较高存活水平 ,而在未灭菌土缩影中其存活数量在整个跟踪过程中持续下降至约 4 5logcfug- 1 土。

发光酶基因标记的华癸根瘤菌JS5A16L在紫云英根圈的定殖动态

在土壤一盒栽、盆栽微宇宙系统（Ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ）中和田间条件下，研究了发光酶基因（ｌｕｘＡＢ）标记的华癸根瘤菌ＪＳ５Ａ１６Ｌ在紫云英根圈的定殖动态、分布范围及结瘤情况。在盒栽系统中，ＪＳ５Ａ１６Ｌ的定殖密度在紫云英出苗２天后达到最高水平（７．８８ ｌｐｇ ｃｆｕ／克根）（ｃｆｕ为ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ的缩写），然后开始下降，并保持在一个相对稳定的水平；５８天后又有所回升，且能散布至种子下方２２ｃｍ处的根段部位。盆栽条件下的定殖动态与盒栽系统中的相似，紫云英播种３天后，ＪＳ５Ａ１６Ｌ可达最高定殖水平（６．９２ ｌｏｇ ｃｆｕ／株根系），随后开始缓慢下降，直至３２天时仍维持在一个相对稳定水平。ＪＳ５Ａ１６Ｌ在田间条件的定殖动态则不同，播种后３０天时定殖密度达到最大值（７ ．０３ ｌｏｇ ｃｆｕ／克根），９０天后降到最低值（５． ２４ ｌｏｇ ｃｆｕ／克根），然后又开始上升，１６０天时为７．８７ ｌｏｇ ｃｆｕ／克根，甚至在地上部植株收割后２０天仍可维持在７．８９ ｌｏｇ ｃｆｕ／克根。接种该菌株可显著提高紫云英的生物学产量。

用Tn5标记带发光酶基因的华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakui)7653R质粒

在ｐＲＫ２０７３的辅助作用下，通过三亲本接合转移，将Ｔｎ５（ｓａｃＢ－ｌｕｘＡＢ）插入华癸根瘤菌７６５３Ｒ菌株基因组中。将３２００个Ｔｎ５标记菌株影印到含有８％蔗糖的ＹＭＡ平板，检测这些菌株的发光酶活性和新霉素抗性。共获得８个菌株，其选择标记消失。质粒检测发现其共生质粒有不同程度的缺失甚至消除。结瘤实验证明，所有共生质粒部分缺失（有的缺失达１／３）的菌株依然结瘤。经用ｌｕｘＡＢ探针的分子杂交证实，８个菌株中有３个对应的标记菌株其Ｔｎ５插在共生质粒上。

应用发光酶基因标记检测大豆遗传改造根瘤菌在田间应用中的占瘤率

通过含发光酶基因ｌｕｘＡＢ的转座自杀质粒ｐＨＮＣ３，将发光酶基因整合到优良快生型大豆根瘤菌ＨＮ０１基因组中，得到具有发光活性的遗传改造菌株ＨＮＯ１ＬＣ０２。应用ＨＮ０１ＬＣ０２进行无菌盆栽和田间试验。结果表明，无菌盆栽条件下发光工程根瘤菌在黑农３９大豆根系上所形成的根瘤均具有发光活性，并能用Ｘ光片记录下来，利用发光工程根瘤菌所形成根瘤的发光活性，考察了发光工程根瘤菌在田间栽培条件下的检测方法和占瘤率的测定。

发光酶基因标记及其在微生物分析中的应用

发光酶基因标记及其在微生物分析中的应用华中农业大学生命科学院微生物系武汉４３００７０莫才清，周俊初，李阜棣近年来，应用发光酶基因作为标记基因，研究各种不同微生物生命活动的报进越来越多。本文拟对此问题作如下几个方面简单综述：１细菌发光的生化与遗传基础地...

利用发光酶基因监测根瘤菌重组质粒的转移性

经三亲本杂交,比较测定了重组大豆根瘤菌HN01DNL和TA11DNL中所含重组质粒pHN307在人工滤膜和灭菌土壤杂交条件下、向华癸中生根瘤菌7653R和荧光假单胞菌Pf.X1-5的转移频率;并初步跟踪了pHN307在根盒-土壤缩影、小区试验和环境释放中向土著细菌的转移性,为考察所构建重组根瘤菌在田间应用时的安全性提供了一定的实验依据。

荧光假单胞菌AS1.867和3-PHB的luxAB基因标记及其在小麦根际的定殖

通过三亲本杂交方法成功地用发光酶基因 lux AB标记荧光假单胞菌 ( Pseudomonasflu-orescens) AS1 .86 7- L和 3 - PHB菌株 ,获得的标记菌株 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L在不同的条件下能稳定发光。将 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L制成固体微生物接种剂 ,并利用土壤微缩系统将其接种于小麦 ,研究它们在小麦根际的定殖动态和散布规律。结果发现 ,二株标记菌株在灭菌土壤上的定殖水平高于不灭菌土壤 ,在垂直方向上定殖主要发生于 0～ 8cm根段间 ,且随着深度的增加而降低。接种菌株在第 7天之前就已达到最高定殖水平 ,在每克根的初始接种量为 2 .3 2× 1 0 8cfu时 ,第 7天的灭菌土壤中 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L的根际菌数分别为 9.6 7× 1 0 6cfu和 6 .90× 1 0 6cfu,不灭菌土壤的根际菌数为 1 .41× 1 0 5cfu和 7.71× 1 0 5cfu。随着时间的延长 ,定殖数量均明显降低 ,3 - PHB- L在 40

一株克服地黄连作障碍有益菌的鉴定及其LuxAB基因标记

[目的]研究对克服地黄(Rehmannia glutinosa)连作障碍有益的43号菌的性质及其对地黄连作障碍的作用效果。[方法]利用细菌16S rDNA的保守序列进行比对,结合形态学观察、革兰氏染色和生理生化等特征对筛选得到的能够克服地黄连作障碍的43号菌进行鉴定;利用LuxAB发光酶基因对其进行标记,经抗性平板筛选,滴加葵醛在暗室进行检测,看是否得到了重组菌株;比较标记前后菌株对培养基中加入生地提取液的组培苗的作用效果。[结果]鉴定结果表明,43号菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。检测结果表明,得到重组菌株,命名为C-43。经过比较,标记前后菌株的生理生化特性基本没有变化,确定C-43对克服地黄连作障碍仍然有益。[结论]经过标记后的恶臭假单胞菌C-43号菌可用于后续的大田研究。

导入四碳二羧酸转移酶基因对费氏中华根瘤菌共生固氮效率的影响

将来自苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti)的四碳二羧酸转移酶基因(dctABD)经 pIJ2 92 5克隆到广宿主、稳定性质粒 pTR10 2上 ,获得诱导型表达的重组质粒 pHN2 0 2。在此基础上再引入来自 pDB30所含的发光酶基因 (luxAB)作分子标记 ,以 pTR10 2为基础构建成带有dctABD和luxAB的重组质粒 pHN2 0 5。经三亲本接合转移 ,将重组质粒 pHN2 0 5导入费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobium fredii)HNO1,GR3和YC4。与出发菌相比较的盆栽试验结果表明 :HN0 1(pHN2 0 5)和GR3(pHN2 0 5)分别在宁镇一号和川早一号大豆上能显著提高植株地上部分干重 (生物量 )和总氮量 ,YC4 (pHN2 0 5)在黑龙 33大豆上能同时显著提高植株地上部分干重 (生物量 ) ,总氮量和根瘤鲜重。本研究结果表明 :导入dctABD基因对共生固氮效率的增效性与受体根瘤菌和大豆品种等因素有关。以luxAB为报告基因进行的转移接合子培养条件下分离单菌落和共生条件下形成根瘤的发光活性检测结果表明 :pHN2 0 5可在供试费氏中华根瘤菌中稳定遗传。