利用Tn5-1063转座诱变法分离苜蓿中华根瘤菌042BM noeB基因的研究

采用三亲本杂交方法将带有Tn5 10 6 3(含luxAB)的质粒pRL10 6 3a导入苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti) 0 4 2BM ,进行转座子插入诱变 ,在含有氯霉素、卡那霉素的TY平板上筛选接合子。通过结瘤试验 ,从 10 0 0个突变株中 ,筛选到 3个结瘤突变株 0 4 2BMR5、0 4 2BMR11和 0 4 2BRM2 9。它们都表现出发光酶活性 ,表明转座子正向插入到基因组中的某个启动子下游。Southern杂交结果证实 ,转座子均为单一位点插入。对 0 4 2BMR5突变株基因组进行反向PCR ,扩增位于Tn5 10 6 3两端的侧翼序列。测序结果表明 ,转座子插入到苜蓿中华根瘤菌的共生质粒pSymAnoeB基因内。根据基因组中noeB上游和下游序列扩增出 0 4 2BMnoeB ,其与苜蓿中华根瘤菌 10 2 1noeB的同源性为 98% ,而与NoeB蛋白的氨基酸序列相似性为 95 %。疏水性分析发现 ,NoeB是一个跨膜蛋白 ,在N末端有 4个跨膜区 ,其中包含 3个初级螺旋和 1个次级螺旋。