脑缺血大鼠脑组织中发动蛋白相关蛋白1和线粒体融合基因2的动态表达

目的:探讨脑缺血后线粒体分裂蛋白及融合蛋白表达水平的变化。方法:72只大鼠随机分为脑缺血后组及假手术组,每组18只。采用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线栓塞大脑中动脉建立脑缺血模型。应用苏木精-伊红染色(HE染色)观察大脑皮质神经元形态结构,蛋白免疫印迹法检测脑组织Drp1及Mfn2的蛋白含量,rt-PCR检测Drp1及Mfn2的mRNA基因的表达情况。结果:脑缺血组的Drp1蛋白及其mRNA基因的表达明显高于假手术组,且随着时间的延长表达逐渐增加(P<0.01);脑缺血组Mfn2蛋白及其表达mRNA基因的表达低于假手术组,且随着时间的延长表达逐渐减少(P<0.01)。结论:线粒体分裂和融合蛋白表达异常可能是脑缺血后脑组织损伤的重要机制。

miR-878靶向调控Pim1促进线粒体分裂导致心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤是导致急性心肌梗死患者不良心血管结局的重要原因。然而,目前对MI/R损伤的分子机制仍不明确。本文旨在确定微小RNA-878(miR-878)对MI/R损伤的影响及其分子机制。方法在H9c2细胞中建立缺氧/复氧(H/R)模型。采用CCK-8法检测细胞活力。采用生化试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)含量。流式细胞术分析细胞凋亡水平。采用免疫荧光法及激光共聚焦显微镜分析线粒体形态。采用免疫荧光法检测线粒体活性氧(mtROS)水平。使用双荧光素酶报告基因实验研究miR-878与Pim1的结合位点。RNA免疫沉淀(RIP)实验验证miR-878与Pim1的结合关系。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测基因的表达水平。结果与对照组相比,miR-878在H/R处理的H9c2细胞中表达显著升高((1.00±0.25)vs(9.70±2.63),P<0.01)。在H/R诱导的细胞中,转染miR-878抑制剂能够显著增加细胞活力((46.67±3.00)vs(74.62±4.08),P<0.0001),并降低LDH释放量((358.58±41.71)vs(179.09±15.59),P<0.0001)及细胞凋亡率((43.41±0.72)vs(27.42±4.48),P<0.01)。同时,下调miR-878表达能够显著抑制DRP1介导的线粒体过度分裂及mtROS产生((6.60±0.57)vs(4.32±0.91),P<0.0001)。机制研究显示,miR-878能够靶向结合Pim1 mRNA的3'-UTR区域并抑制Pim1的表达水平。挽救实验证明,下调Pim1表达能够显著逆转miR-878抑制剂抗H9c2细胞损伤的作用(均P<0.01),并出现线粒体过度分裂及mtROS产生增加(均P<0.05)。结论在H/R条件下,miR-878通过靶向抑制Pim1表达而促进DRP1介导的线粒体过度分裂,最终导致心肌细胞损伤。

Drp1的调控对PINK1突变转基因果蝇的保护作用

帕金森病(PD)是以黑质致密部多巴胺神经元选择性减少和胞浆内路易小体的形成为特征的神经退行性疾病。研究发现,PTEN诱导激酶1(PINK1)基因突变导致家族性早发型帕金森病的发生。在转基因果蝇中,PINK1功能丢失导致间接飞行肌缺陷,线粒体结构、功能障碍,多巴胺神经元丢失。本研究在PINK1突变PD转基因果蝇中,进行发动蛋白相关蛋白1(Drp1)过表达和敲低,探索Drp1对PD转基因果蝇的保护作用及其可能机制。本研究选用MHC-Gal4/UAS系统的PD转基因果蝇模型,特异性启动PINK1B9基因于果蝇肌肉组织中表达;运用Drp1基因过表达和RNA干扰干预PINK1B9转基因果蝇,研究其对PD转基因果蝇的作用。结果显示,不论过表达Drp1还是Drp1敲低均可挽救PINK1突变转基因果蝇,降低翅膀异常率,改善飞行能力,恢复间接飞行肌排列,调节线粒体形态,提高ATP生成量,上调NDUFS3蛋白表达水平。本文结果提示,Drp1的调控挽救PINK1突变转基因果蝇与线粒体呼吸链有关。

Drp1在高糖诱导的大鼠心肌细胞肥大中的作用研究

目的:探讨发动蛋白相关蛋白1(Drp1)在高糖诱导的心肌细胞肥大模型中的表达及其作用机制。方法:原代乳大鼠心肌细胞培养,用高糖诱导建立心肌细胞损伤模型,将细胞分为对照组、高渗透压组、DMSO组、高糖组和高糖+线粒体分裂抑制剂1(Mdivi-1)组。用麦胚凝集素荧光染色检测单个心肌细胞表面积;用线粒体膜电位(MMP)检测试剂盒(JC-1)检测心肌细胞MMP水平;Western blot检测心肌细胞肥大标志物心房钠尿肽(ANP)及Drp1和Drp1在Ser616/Ser637位点的磷酸化蛋白[p-Drp1(Ser616/Ser637)]的蛋白水平。结果:与对照组相比,高渗透压组各检测结果均无显著差异(P>0.05)。与对照组和高渗透压组相比,高糖组心肌细胞的表面积均显著增大(P<0.01),MMP显著降低(P<0.01),而Drp1总蛋白表达无显著变化(P>0.05);心肌细胞ANP表达显著增加(P<0.01),p-Drp1(Ser616)水平显著升高(P<0.05),而p-Drp1(Ser637)水平显著降低(P<0.05)。与高糖组相比,高糖+Mdivi-1组ANP和p-Drp1(Ser616)蛋白水平显著降低(P<0.05),而p-Drp1(Ser637)的水平显著升高(P<0.05)。结论:高糖诱导心肌细胞肥大的机制,与Drp1在Ser616位点磷酸化水平升高、Ser637位点磷酸化水平降低导致的线粒体分裂增加有关。

尿酸对大鼠肾细胞线粒体损伤及Pgam5/Drp1表达的影响

目的:探讨尿酸干预大鼠肾细胞对其线粒体损伤及磷酸甘油酸变位酶家族成员5(Pgam5)和发动蛋白相关蛋白1(Drp1)表达的影响。方法:0.6 mmol/L尿酸干预大鼠肾细胞NRK-52E,采用MTT法检测细胞活力,Hochest 33258染色观察细胞形态,流式细胞术检测细胞凋亡水平,透射电镜观察线粒体形态结构,免疫荧光染色观察Pgam5和Drp1阳性表达情况,RT-qPCR检测线粒体中Pgam5 m RNA的表达水平,Western blot检测细胞质基质中Pgam5和Drp1蛋白表达水平。结果:与正常细胞比较,尿酸干预组细胞活力显著降低,凋亡率显著升高,线粒体肿胀、空泡化,嵴断裂,线粒体中Pgam5的m RNA表达显著降低,而细胞质基质中Pgam5和Drp1的蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。结论:尿酸可破坏肾细胞线粒体结构,上调细胞质基质中Pgam5/Drp1表达,诱导细胞凋亡。

法舒地尔减轻大鼠缺血/再灌注心肌线粒体损伤和细胞凋亡

目的观察线粒体融合蛋白2(Mfn2)和发动蛋白相关蛋白1(Drp1)在法舒地尔抑制Rho激酶对抗心肌缺血/再灌注(I/R)损伤中的变化,并分析其意义。方法离体大鼠心脏,结扎冠状动脉左前降支缺血0.5 h,持续再灌注2 h模拟心肌I/R损伤模型。实验分假手术组、I/R组、法舒地尔组。测定心室动力学变化和再灌注期间冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,透射电镜观察心肌超微结构改变,免疫组织化学染色检测Rho激酶下游磷酸化的蛋白磷酸酶1调节亚基12A(p-PPP1R12A/p-MYPT1)表达,Western blot法检测Mfn2、Drp1和裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)蛋白水平。结果与假手术组相比,各组再灌注不同时间点左心室收缩和舒张功能均降低,LDH释出增加;与I/R组相比,法舒地尔组左心室收缩和舒张功能得到改善,LDH释出减少;透射电镜结果显示I/R组心肌明显肌丝断裂、肌原纤维结构不完整、线粒体损伤,免疫组织化学染色显示p-MYPT1蛋白表达上调;与I/R组比,法舒地尔组心肌肌原纤维和线粒体损伤减轻,p-MYPT1蛋白表达下调;Western blot结果显示,与假手术组相比,I/R组Mfn2蛋白表达减少,Drp1和c-caspase-3蛋白水平增加,与I/R组相比,法舒地尔组Mfn2蛋白水平无明显变化,Drp1和c-caspase-3蛋白水平减少。结论法舒地尔抑制Rho激酶的抗心肌I/R损伤作用与Mfn2蛋白表达无明显关联,可能与降低Drp1蛋白表达减少线粒体损伤,进而减少细胞凋亡有关。

磷酸甘油酸变位酶5与坏死样凋亡

多年来人们认为细胞死亡方式主要包括坏死和凋亡。坏死是不受特定调控的被动死亡方式，表现为细胞器肿胀，细胞膜破裂，内容物渗出，有炎症反应[1]，而凋亡则是由细胞内胱天蛋白酶（caspase）调控的一种主动死亡方式，因caspase激活导致细胞内底物裂解，破坏胞膜囊泡形成凋亡小体，死亡过程中无内容物渗出，不引起炎症反应[2]。

抗纤益心方通过调节Drp1活性抑制去甲肾上腺素诱导大鼠H9c2细胞肥大

目的:探讨抗纤益心方对去甲肾上腺素(NE)诱导大鼠H9c2细胞肥大的影响及作用机制。方法:H9c2细胞培养24 h,用NE诱导建立H9c2细胞肥大模型,将细胞分为空白对照组、模型对照组、抗纤益心方250 mg/mL组、线粒体动力分裂蛋白1抑制剂1×10^(-5)mol/L组、线粒体动力分裂蛋白1抑制剂1×10^(-5)mol/L+抗纤益心方250 mg/mL组,药物作用24 h后,显微镜下观察细胞形态及检测单个心肌细胞表面积;RT-PCR法检测细胞肥大因子心房钠尿肽(Anp)、脑钠肽(Bnp)mRNA表达;电镜检测细胞线粒体超微结构;JC-1检测细胞线粒体膜电位(MMP)水平;Western blot法检测细胞ANP、BNP、发动蛋白相关蛋白1(DRP1)及其p-DRP1(s616)蛋白表达。结果:与空白对照组比较,模型对照组细胞相对表面积增大,Anp、Bnp mRNA表达均上调,线粒体结构损伤,MMP水平明显下调(P<0.05),ANP、BNP、p-DRP1蛋白表达上调(P<0.05);与模型对照组比较,抗纤益心方组及抗纤益心方+线粒体动力分裂蛋白1抑制剂组,细胞相对表面积减小、Anp、Bnp mRNA表达下调(P<0.05),线粒体结构损伤改善,MMP水平上调(P<0.05),ANP、BNP及p-DRP1蛋白表达下调(P<0.05或P<0.01)。结论:抗纤益心方能够抑制NE诱导H9c2细胞肥大,其机制可能与改善线粒体结构与功能,下调DRP1去磷酸化表达有关。