研究揭示细菌发动蛋白IniA调控结核耐药的新机制

中国科学院院士饶子和率领的上海科技大学科研团队与中国科学院生物物理研究所研究员胡俊杰课题组合作,在《自然-通讯》(Nature Communications)上发表题为Mycobacterial dynamin-like protein IniA mediates membrane fission 的研究论文。他们率先解析了一线抗结核药物—异烟肼诱导蛋白IniA的晶体结构,发现其具有典型的细菌发动蛋白(dynamin)构象,并发挥膜分裂的功能,由此揭示了IniA 蛋白参与药物耐受的新机制,对解决结核病耐药性问题具有重要指导意义。

小分子泛素相关修饰物蛋白修饰对于发动蛋白相关蛋白1维持线粒体动力学平衡的影响

线粒体是细胞内能量代谢的中心,对于维持细胞稳态而言,其形态和功能的调控至关重要。小分子泛素相关修饰物蛋白(small ubiquitin-related modifier protein,SUMO)修饰和发动蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)在细胞调控中扮演着重要角色,尤其与线粒体动力学密切相关。SUMO修饰是一种重要的蛋白质修饰形式,通过将靶蛋白与SUMO相连来调节这些蛋白质的功能。而DRP1是线粒体分裂蛋白,负责调节线粒体的形态和功能。近年来研究发现,SUMO修饰与DRP1之间存在复杂的相互作用网络,对于线粒体的分裂、融合、自噬等起着重要作用。在DRP1的可变结构域中,有8个赖氨酸残基可以在线粒体锚定蛋白连接酶(mitochondrial-anchored protein ligase,MAPL)的作用下完成SUMO修饰。并且不同亚型的SUMO蛋白对于DRP1功能的调节也不同。SUMO1修饰会使DRP1向线粒体富集,促进线粒体的分裂;SUMO2/3修饰会使DRP1向细胞质转移,减少线粒体的分裂。在实际的细胞程序中,不同亚型SUMO的修饰水平往往是由SUMO特异性蛋白酶(SUMO-specific proteases,SENPs)的类型决定。线粒体作为细胞中重要的能量供应细胞器,其动力学的异常往往会导致诸多疾病的发生,例如:心肌缺血再灌注性损伤、阿尔茨海默病、脑血栓、视网膜病变等。本文综述了SUMO修饰与DRP1之间相互作用对于线粒体动力学调控的研究进展,为进一步揭示细胞调控机制和发展相关疾病的治疗策略提供一定的参考。

发动蛋白及其蛋白超家族的功能

发动蛋白(dynamin)作为一种复杂的多结构域蛋白质,因其在促进内吞囊泡形成和断裂,诱导囊泡从质膜脱离过程中发挥重要功能而广为人知。其经典功能是在网格蛋白介导型胞吞作用中发挥“膜剪刀”的作用,但是由于其结构和功能的多样性,不同同源异构体间具有组织表达和分布差异性,促使其广泛参与细胞内重要的生理过程,因此具有重要的研究价值。近期研究揭示了发动蛋白的一些非经典功能,包括参与调控网格蛋白介导型胞吞作用(clathrin-mediated endocytosis,CME)的早期阶段、影响肌动蛋白细胞骨架和细胞分裂等。本文主要综述了发动蛋白在CME膜剪切过程中发挥经典功能的最新进展,总结了其非经典功能的挖掘现状,同时阐述了其他发动蛋白超家族蛋白(dynamin superfamily protein,DSP)成员的功能,如抵抗病原体入侵、参与调控线粒体、过氧化物酶体、液泡膜的分裂,以及线粒体、内质网、液泡、过氧化物酶体膜的融合,此外,DSP成员也在调节细胞器间的物质运输,介导细菌胞质分裂和囊泡分泌等方面发挥功能。本综述通过对DSP成员功能的总结和梳理,将为人类疾病相关的分子机制研究提供思路。

发动蛋白(dynamin)抑制剂Dyngo-4a在大鼠骨髓间充质干细胞内吞葡聚糖过程中存在脱靶效应

目的研究发动蛋白(DNM)抑制剂Dyngo-4a在依赖DNM的内吞途径中可能存在的脱靶作用。方法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)并进行流式细胞术鉴定,将细胞分为抑制剂对照组、Dyngo-4a处理组、转染阴性对照(si-NC)组、DNM2小干扰RNA(si-DNM2)转染组、转染和Dyngo-4a共处理组。反转录PCR和Western blot法验证DNM2基因沉默效率,CCK-8法检测Dyngo-4a处理后细胞活性变化,共聚焦显微镜检测内吞的Dylight649标记的转铁蛋白(transferrin-Dylight649)和四甲基罗丹明标记的葡聚糖(dextran-TMR)阳性的囊泡数量以及平均荧光强度。结果使用小干扰RNA能显著下调BMSC的DNM2的mRNA和蛋白表达,转染组内吞的转铁蛋白囊泡数量与转染阴性对照组比较明显降低,si-DNM2转染组内吞的葡聚糖囊泡数量和平均荧光强度与si-NC组比较变化不明显,转染si-DNM2和Dyngo-4a共处理组与单独si-DNM2转染组比较,Dyngo-4a处理组与抑制剂对照组比较,葡聚糖囊泡数量和平均荧光强度均明显降低。结论Dyngo-4a作为靶向DNM的抑制剂在葡聚糖内吞进BMSC过程中存在脱靶效应。

发动蛋白抑制剂dynasore的功能及在疾病治疗中的研究进展

发动蛋白(dynamin)超家族存在于所有细胞生命活动中,在胞膜构成、肌动蛋白束和先天免疫等方面发挥重要作用。发动蛋白作为该家族的主要成员,是一种多结构域的机械化学鸟苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase,GTPase)蛋白,对鸟嘌呤核苷酸具有低亲和力、高基础水解率,能自组装成高阶螺旋结构^([1]),在包膜重塑、膜裂变和跨高尔基体出芽等作用中发挥着重要作用^([2])。

β-淀粉样肽对人SH-SY5Y细胞突触素、发动蛋白I及衔接蛋白180表达的影响

目的探讨β-淀粉样肽（Ap）对人SH—SY5Y神经母细胞瘤细胞突触素（syn）、发动蛋白I（DynI）及衔接蛋白180（AP180）表达的影响。方法分别应用0．01、0．1、1、2及5-μmol／LAβ1-42处理SH-SY5Y细胞，对照组细胞不加任何处理。MTT法检测细胞增殖情况，western blotting检测0．5、1μmol／LAμ1-42处理组及对照组细胞Syn、DynI和AP180蛋白表达，RT—PCR检测1μmol／LAβ1-42处理组及对照组细胞Syn、DynI和AP180mRNA表达。结果0．1μmol／LAl3Im处理细胞即可出现细胞增殖率下降，并呈剂量依赖性负性相关关系．与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；0．5μmol／LAB1-42处理细胞可见DynI蛋白表达降低，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；1μmol／LAβ1-42处理细胞可见Syn、DynI蛋白及mRNA表达均降低，与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；但未见AP180蛋白及mRNA表达水平发生改变。结论AB1-42可引起人SH-SY5Y细胞Syn和DynI表达降低，该改变可能与AD发病中学习记忆能力减退有关。

血管性痴呆大鼠海马突触素、发动蛋白Ⅰ的mRNA及蛋白表达变化

目的 探讨血管性痴呆（VaD）大鼠海马突触素、发动蛋白Ⅰ的mRNA及蛋白表达变化.方法 利用改良四血管法制备血管性痴呆大鼠模型.通过Morris水迷宫观察大鼠空间探索及学习记忆情况,采用Real-time及Western-blot法分别检测大鼠海马突触素、发动蛋白Ⅰ的mRNA与蛋白水平,并与假手术组进行比较.结果 VaD组大鼠各时间点平均逃避潜伏期及第1次穿越平台所用时间均显著长于假手术组（均P＜0.01）,平台穿越次数明显减少（P＜0.05）.VaD组海马突触素及发动蛋白Ⅰ蛋白表达及mRNA表达显著低于假手术组（P ＜0.05～0.01）.结论 脑缺血引起大鼠海马组织突触素、发动蛋白Ⅰ表达降低,可能与VaD发病中学习记忆能力减退有关.

强磁重力环境对人成骨细胞发动蛋白-2表达和定位的影响

研究强磁重力环境对人成骨细胞MG-63中发动蛋白-2表达和分布的影响。采用大梯度超导磁体模拟空间重力环境,该超导磁体可以提供3种不同的强磁重力环境(high magnetic gravitational environment,HMGE),即0g(12T),1g(16T)和2g(12T)。将MG-63细胞分别在0g(12T)、1g(16T)、2g(12T)及对照环境(1g,地磁)中培养24h后,采用Real Time PCR、Western印迹以及激光扫描共聚焦显微术等方法检测HMGE对发动蛋白-2的表达及定位的影响。结果显示,与对照组相比,0g(12T)、1g(16T)、2g(12T)环境处理组MG-63细胞中发动蛋白-2在mRNA上的表达量分别上调6.43、15.57、1.29倍;在蛋白质水平上,0g(12T)、1g(16T)环境处理组细胞发动蛋白-2分别上调89%和7%,而2g(12T)环境处理组则下调41%;在对照组中发动蛋白-2弥散分布于细胞质中,而0g(12T)处理组发动蛋白-2则有从细胞边缘向核周集中的趋势。上述结果说明强磁重力环境影响了发动蛋白-2在MG-63细胞中的表达和定位。

β淀粉样肽及冈田酸对大鼠脑内突触素和发动蛋白Ⅰ表达的影响

目的:探讨β淀粉样肽(Aβ)及冈田酸(OA)对大鼠学习记忆能力及脑内突触素和发动蛋白Ⅰ的表达影响。方法:采用立体定向方法将Aβ1-42及OA分别注入SD大鼠双侧海马CA1区,2个月后水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力,Western印迹及实时聚合酶链反应(real-time PCR)检测大鼠脑组织中突触素和发动蛋白及mRNA表达水平。结果:与对照组相比,Aβ注射组、OA注射组及Aβ+OA共同注射组均能引起大鼠学习记忆能力降低,各组脑组织中突触素、发动蛋白Ⅰ及mRNA表达均降低(P<0.01),其中以Aβ+OA共同注射组改变尤为明显。结论:Aβ和OA均可降低大鼠学习记忆能力,降低突触素和发动蛋白Ⅰ的表达,该改变可能与AD发病机制中学习记忆能力减退有关。

促红细胞生成素对大鼠肾间质纤维化发动蛋白-1表达影响

目的探讨促红细胞生成素(EPO)对大鼠肾间质纤维化发动蛋白-1(Drp-1)表达的影响。方法 81只SD大鼠,分为假手术组、对照组和EPO组,每组各27只。EPO组、对照组采用单侧输尿管结扎并剪断建立肾间质纤维化模型,假手术组仅游离输尿管而不结扎和剪断;EPO组予EPO皮下注射;假手术组和对照组给予等量生理盐水皮下注射。各组于术后7、14和21 d取动脉血分离血清检测血肌酐和尿素氮水平。取梗阻侧肾组织行苏木精-伊红和Masson染色,观察肾脏病理学变化。用免疫组化方法检测肾组织Drp-1的表达。结果①EPO组各时点血清肌酐和尿素氮水平显著低于对照组(P<0.01),但高于假手术组(P<0.05)。②EPO组各时点肾组织病理改变较对照组明显减轻,肾小管间质损伤评分和肾间质纤维化相对面积均低于对照组(P均<0.05),但高于假手术组(P<0.05)。③EPO组肾组织的Drp-1表达显著低于对照组(P<0.05),但高于假手术组(P<0.05)。结论 Drp-1在大鼠肾间质纤维化肾组织中表达增加,参与肾脏纤维化过程;EPO可以通过抑制Drp-1表达,从而延缓肾间质纤维化的进展。

发动蛋白-2基因新的单核苷酸多态性分析

目的:检测中央核肌病家系发动蛋白-2(DNM2)基因部分区域单核苷酸多态性(SNP)。方法:对汉族中央核肌病家系P中的4名成员和与其家系无关的7个正常个体进行研究。采用聚合酶链反应(PCR)扩增DNM2基因第8号外显子及上游内含子交界区序列,应用CEQ8000核酸分析仪进行测序。结果:家系P中患者III3、II5在外显子7和8之间的内含子区-104位置上发现G-A多态,此多态位于19号染色体10765292(+);在家系内另外2个正常人I1、I2和与其家系无关的7个正常个体中均发现此多态位点。经检索NCBISNP数据库证实此SNP多态位点尚未被报道。结论:采用测序技术自行检测在11个汉族个体中发现1个尚未报道的位于DNM2基因内的SNP位点,该位点可能与种族遗传背景有关。

发动蛋白-1的脯氨酸和精氨酸富集域功能域与大鼠神经突触小体相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的筛选及鉴定发动蛋白-1(Dynamin-1)的脯氨酸和精氨酸富集域(PRD)功能域在大鼠神经突触小体中的相互作用蛋白。方法构建Dynamin-1 PRD功能域的重组原核表达质粒pGEX-4T-2-PRD,通过大肠杆菌表达系统进行诱导表达;谷胱甘肽琼脂糖凝脂柱纯化得到融合蛋白GST-PRD,继而利用谷胱甘肽巯基转移酶沉淀技术,筛选出GST-PRD融合蛋白与分离提取的大鼠神经突触小体的相互作用蛋白,并通过液相质谱技术结合数据库,对上述获得的相互作用蛋白进行分析、鉴定。结果通过构建pGEX-4T-2-PRD重组质粒及诱导表达,成功纯化出了融合蛋白GST-PRD;同时成功提取了大鼠神经突触小体,经谷胱甘肽巯基转移酶沉淀技术联合液相质谱分析,获得在大鼠神经突触小体中与Dynamin-1的PRD域有相互作用的蛋白共35个,分别属于突触囊泡相关蛋白、细胞骨架蛋白、代谢酶及其他类的蛋白。结论本研究获得的与Dynamin-1的PRD域有相互作用的蛋白共35个。

不同聚集形式β-淀粉样肽对人SH-SY5Y细胞发动蛋白Ⅰ和突触素表达的影响

目的探讨不同聚集形式的β-淀粉样肽(Aβ)对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)发动蛋白Ⅰ(DynⅠ)和突触素(Syn)表达的影响。方法制备不同聚集形式的Aβ1～42处理SH-SY5Y细胞,采用蛋白质印迹法检测细胞中DynⅠ及Syn蛋白表达水平;采用免疫组织化学染色方法检测10例阿尔茨海默病(AD)患者及8例老年同龄对照者尸解后脑海马结构中β-淀粉样肽寡聚体(AβOs)表达水平。结果 Aβ单体或Aβ纤丝体处理SH-SY5Y细胞未见DynⅠ及Syn蛋白表达水平显著变化,AβOs处理细胞可见DynⅠ及Syn蛋白表达水平降低(P<0.05);AD患者海马及内嗅区皮质神经元内AβOs的表达显著高于老龄对照者(P<0.05)。结论细胞内表达的AβOs可能是引起AD患者脑中网格蛋白内吞调节蛋白———DynⅠ表达下降及突触丧失的主要Aβ神经毒性形式,该改变可能与AD发病机制中学习记忆能力减退有关。

脑缺血大鼠脑组织中发动蛋白相关蛋白1和线粒体融合基因2的动态表达

目的:探讨脑缺血后线粒体分裂蛋白及融合蛋白表达水平的变化。方法:72只大鼠随机分为脑缺血后组及假手术组,每组18只。采用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线栓塞大脑中动脉建立脑缺血模型。应用苏木精-伊红染色(HE染色)观察大脑皮质神经元形态结构,蛋白免疫印迹法检测脑组织Drp1及Mfn2的蛋白含量,rt-PCR检测Drp1及Mfn2的mRNA基因的表达情况。结果:脑缺血组的Drp1蛋白及其mRNA基因的表达明显高于假手术组,且随着时间的延长表达逐渐增加(P<0.01);脑缺血组Mfn2蛋白及其表达mRNA基因的表达低于假手术组,且随着时间的延长表达逐渐减少(P<0.01)。结论:线粒体分裂和融合蛋白表达异常可能是脑缺血后脑组织损伤的重要机制。

发动蛋白对心脏收缩-频率反应的调控作用

目的观察DNM2在心脏收缩-频率反应(force-frequency response,FFR)中的作用。方法分离培养大鼠心脏细胞。构建包含DNM2显性失活突变体的腺病毒载体,将其转染成年大鼠心室肌细胞,并分析DNM2功能失活对心肌细胞FFR的影响。通过免疫印迹方法检测受磷蛋白与钙—钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱδ(CaMKⅡδ)的活性变化。用选择性药物抑制DNM2的GTP酶活性,观察离体心脏FFR的变化情况。结果 DNM2显性失活减弱了心肌细胞频率依赖的缩短分数和钙瞬变变化,这与细胞钙水平升高及CaMKⅡδ活性上调有关。器官层面的研究显示,抑制DNM2活性还可导致心脏FFR受到明显的损伤。结论 DNM2活性对心脏正常FFR的维持是必需的;作为调控FFR的重要分子,DNM2可能成为心力衰竭等心脏疾病的药物干预靶点。

发动蛋白在EMCV感染Hela细胞中作用的研究

脑心肌炎病毒(EMCV)是一种重要的人畜共患传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失,发动蛋白(Dynamin)是一种与内吞途径有关的蛋白,可以为多种内吞途径提供动力。为了检测发动蛋白在EMCV感染Hela细胞中作用,用发动蛋白的特异性抑制剂作用于Hela细胞后,再用EMCV感染Hela细胞,检测细胞内EMCV结构蛋白VP1含量和上清的病毒滴度、病毒拷贝数。VP1含量、病毒滴度和病毒拷贝数结果均提示经发动蛋白的特异性抑制剂作用后EMCV感染Hela细胞受到抑制。

发动蛋白在病毒感染宿主细胞中作用研究进展

发动蛋白(Dynamin,Dyn)是生物分子进入细胞的看门人,参与多种生理生化过程。越来越多的研究表明,发动蛋白具有调节病毒入侵宿主细胞的作用。病毒可利用发动蛋白运输复制所需的蛋白质和相关组件,以便于病毒的侵入和组装。本文综述了近年来发动蛋白在病毒感染过程中的作用研究进展,为病毒感染宿主的潜在靶点和后期抗病毒药物研发提供了新的思路和方法。

发动蛋白1在结直肠癌中的表达和临床意义及其与自噬的关系

目的分析发动蛋白1(DNM1)基因表达与结直肠癌(CRC)患者临床病理参数及预后的关系,探究DNM1与自噬机制的关联。方法应用肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库分析DNM1在CRC患者正常肠黏膜与癌组织中、肿瘤早期(TNMⅠ期与Ⅱ期)与晚期(TNMⅢ期与Ⅳ期)癌组织中的mRNA水平差异,用Kaplan-Meier法进行生存时间估计及预后分析;用免疫组织化学染色检测118例CRC患者癌组织的DNM1蛋白表达情况,分析其表达特点与临床病理参数及预后的关系;用基因集富集分析(GSEA)CRC患者癌组织中DNM1与自噬相关的信号通路;使用共聚焦显微镜检测并分析DNM1(和其他5个自噬相关蛋白ATG9B、ULK1、Beclin-1、P62/SQSTM1、ATG16L1)与自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)的免疫荧光双染色的皮尔逊相关系数(PCC)。结果DNM1在CRC肿瘤组织中表达升高,在肿瘤晚期的表达显著升高(P<0.05);Kaplan-Meier生存分析示:DNM1的表达量与肿瘤预后负相关[HR=1.71,95%CI(1.21,2.40),P<0.01]。DNM1阳性强度与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、癌结节、远处转移、神经及脉管侵犯、分化程度、组织学分型、特殊组织学分型有关(均P<0.01)。有序logistic回归模型验证了肿瘤分化及DNM1的阳性程度均为CRC患者不良预后的危险因素,DNM1强阳性与腺癌复发正相关(P<0.05)。DNM1高表达涉及负调控雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)等自噬的关键信号通路(P<0.05,FDR<0.001)。六组免疫荧光双染色中DNM1与LC3B两基因表达模式的相关性最大。结论DNM1高表达是CRC患者的不良预后因素,可能通过正向调控自噬与肿瘤进展有关。

miR-878靶向调控Pim1促进线粒体分裂导致心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤是导致急性心肌梗死患者不良心血管结局的重要原因。然而,目前对MI/R损伤的分子机制仍不明确。本文旨在确定微小RNA-878(miR-878)对MI/R损伤的影响及其分子机制。方法在H9c2细胞中建立缺氧/复氧(H/R)模型。采用CCK-8法检测细胞活力。采用生化试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)含量。流式细胞术分析细胞凋亡水平。采用免疫荧光法及激光共聚焦显微镜分析线粒体形态。采用免疫荧光法检测线粒体活性氧(mtROS)水平。使用双荧光素酶报告基因实验研究miR-878与Pim1的结合位点。RNA免疫沉淀(RIP)实验验证miR-878与Pim1的结合关系。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测基因的表达水平。结果与对照组相比,miR-878在H/R处理的H9c2细胞中表达显著升高((1.00±0.25)vs(9.70±2.63),P<0.01)。在H/R诱导的细胞中,转染miR-878抑制剂能够显著增加细胞活力((46.67±3.00)vs(74.62±4.08),P<0.0001),并降低LDH释放量((358.58±41.71)vs(179.09±15.59),P<0.0001)及细胞凋亡率((43.41±0.72)vs(27.42±4.48),P<0.01)。同时,下调miR-878表达能够显著抑制DRP1介导的线粒体过度分裂及mtROS产生((6.60±0.57)vs(4.32±0.91),P<0.0001)。机制研究显示,miR-878能够靶向结合Pim1 mRNA的3'-UTR区域并抑制Pim1的表达水平。挽救实验证明,下调Pim1表达能够显著逆转miR-878抑制剂抗H9c2细胞损伤的作用(均P<0.01),并出现线粒体过度分裂及mtROS产生增加(均P<0.05)。结论在H/R条件下,miR-878通过靶向抑制Pim1表达而促进DRP1介导的线粒体过度分裂,最终导致心肌细胞损伤。

温阳活血利水方含药血清对足细胞组织蛋白酶L、发动蛋白以及微丝、微管的影响

目的探讨温阳活血利水方治疗原发性肾病综合征蛋白尿的可能作用机制。方法将足细胞分为正常对照组、模型组、地塞米松组、10%中药血清组、20%中药血清组、空白对照组。除正常对照组、空白对照组外,其余各组用氨基核苷嘌呤霉素粉剂制备足细胞损伤模型。正常对照组和模型组加入完全培养基5 ml,地塞米松组加入392μg/L地塞米松5 ml,10%中药血清组、20%中药血清组、空白对照组分别加入10%中药血清、20%中药血清、空白对照血清各5 ml。RT-PCR法与Western blot分别检测各组足细胞胞浆组织蛋白酶L(CatL)、发动蛋白mRNA和蛋白表达含量,并用激光共聚焦观察各组中足细胞骨架微丝、微管的形态结构变化。结果与正常组比较,模型组CatL mRNA与蛋白含量升高,发动蛋白表达含量降低(P<0.01);与模型组比较,各中药血清组与地塞米松组CatL mRNA与蛋白表达含量降低,足细胞发动蛋白蛋白表达含量升高(P<0.01);与10%中药血清组比较,20%中药血清组CatL mRNA与蛋白表达含量降低,发动蛋白表达含量升高(P<0.01)。各组间足细胞发动蛋白mRNA表达含量差异无统计学意义(P>0.05)。结论温阳活血利水方可能通过下调足细胞CatL的表达,减少CatL对发动蛋白的酶解,从而稳定细胞骨架中的微丝、微管等结构,减少足突融合,改善蛋白尿。