在PCR-DGGE研究土壤微生物多样性中应用GC发卡结构的效应

应用普通细胞裂解法提取 3株实验菌株 (Escherichia coli DH5α,Staphylococcus aureus SA- 1和 A-grobacterium tumerfaciens 1 31 2 9)的基因组 DNA和应用基于高盐和长时高热的细胞裂解法提取 7种不同土壤样品中的微生物的基因组 DNA,两组不同结构的引物 F3 57GC,R51 8(在正向引物的 5′端有 GC发卡结构 )和 F3 57,R51 8,分别对实验菌株和土壤样品中微生物的 1 6Sr RNA基因 V3区进行扩增 ,均得到了目的片段。比较了不同引物扩增的 1 6S r DNA片段在 DGGE中的不同电泳行为 ,结果表明 ,含 GC发卡结构的PCR扩增产物在 DGGE中能够得到很好的分离 ,而无 GC发卡结构的 PCR产物则不能在 DGGE中获得满意分离。引入 GC发卡结构 。

短发卡结构状RNA体外抑制呼吸道合胞病毒M2基因mRNA水平和病毒蛋白表达的研究

目的观察针对人类呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因mRNA构建的短发卡结构状RNA重组质粒在细胞水平对RSV复制的影响,为利用RNA干扰技术抑制RSV感染的研究奠定基础。方法将已成功构建的重组质粒pshRNA7816/8330转染HEp-2细胞,通过显微镜观察pshRNA7816/8330对RSV感染细胞病变(CPE)的抑制效率,利用四甲基偶氮唑盐比色实验检测pshRNA7816/8330的细胞毒性,经RT-PCR方法检测pshRNA7816对RSVM2mRNA表达的影响,免疫细胞化学染色法检测pshRNA7816对细胞内RSV蛋白的影响。结果pshRNA7816/8330对HEp-2细胞的正常生长没有明显的细胞毒性作用,2个重组质粒均能抑制RSV所致的CPE,但pshRNA7816对CPE抑制作用较pshRNA8330要强,RT-PCR和免疫细胞化学染色法结果显示pshRNA7816能明显降低RSVM2基因mRNA和RSV蛋白表达水平。结论针对RSVM2-1基因所构建的短发卡结构状RNA重组质粒pshRNA7816在细胞水平能有效抑制RSV的CPE形成降低RSVM2mRNA和病毒蛋白表达水平,从而干扰RSV的复制。

一种C波段基于发卡结构的低耦合贴片天线

在收发天线对中,收发天线单元间的距离越近,单元间的耦合越强。为了抑制近距离放置的2个微带贴片天线单元间的互耦,提出一种占用很小平面空间的对称发卡结构,通过引入新的耦合路径进行天线耦合补偿。基于该结构,设计加工了工作频率在5.8 GHz的微带贴片天线对,尺寸为30 mm×50 mm×1 mm。天线单元边缘间距为0.03λ_0。实验测量结果表明,采用该结构能够使天线对在5.8 GHz实现42 dB隔离度,|S_(11)|<-10 dB带宽为1.21%,带宽内隔离度大于40 dB,证明了该设计的有效性。

窄方腔软湍流Rayleigh-Bénard热对流中角涡的三维发卡涡结构

通过直接数值模拟(Direct Numerical Simulation,DNS)求解三维窄方腔湍流Rayleigh-Bénard(RB)热对流流场,讨论尺度比为1/4的三维窄方腔中的流动.三维方腔流场的流线图和速度场与二维流场一致,都反映出大尺度环流和角涡的软湍流流动特征.进一步观察三维流线图发现,在近底板附近流线的走向并不是沿着大尺度环流的方向.转换三维流线图的观察角度,可明显看到近底板附近流线是螺旋状的,并与角涡相连.分析整个流场的涡旋特征发现,在窄方腔热对流中沿底板棱边区域产生涡对与角涡连接形成三维发卡涡流动的结构.

电位控制下发卡型DNA分子识别单碱基多态性

目前的基因芯片检测技术存在着标记烦琐与信号灵敏度低两个矛盾,对于在单点碱基多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)特异性识别方面的成效不能令人满意。本文工作在固定探针分子时引入发卡型结构并结合电势控制杂交过程,利用一类被称为镶嵌式染料的分子对双链 DNA 识别后发出荧光的性质,无须对样品进行事先标记,发展了一种新颖的高效识别 SNP 的方法。

发卡型万能传导在基于核酸分子线路的基因诊断中的应用和性能优化

核酸等温扩增技术作为核酸体外扩增技术,其反应过程始终维持在恒定温度下。与聚合酶链反应相比,核酸等温扩增反应具有优异的便携型,因而被视为最有望实现基因快检甚至即时快检的体外基因扩增方法。然而,由于反应过程中假阳性扩增频发、反应后对产物的检测方法缺乏特异性和灵敏度等缺点,限制了其在实际分析检测中的应用。通过构建发卡型结构万能中转探针,成功地将恒温扩增产物转到一套性能良好的已知核酸分子线路上;借助核酸分子线路的百倍放大性能和序列特异性,实现对上游基因序列信息的精准识别和放大信号输出。针对不同的待测序列,仅需改变发卡型中转探针的序列,即可实现对不同序列目标物的检测。基于中转探针的重要性,本研究对中转探针的设计原理和方法进行了重点阐述,提出并验证了一套行之有效的普适性设计规律,确保中转探针良好的中转效率(信噪比)。利用这一规律获得的中转探针,与核酸分子线路偶联,可成功为低至近单分子(20个拷贝)的模型基因提供显著荧光和电化学信号输出。

基于氧化石墨烯的无酶循环放大荧光信号法检测DNA

基于纳米材料氧化石墨烯的荧光猝灭性能,引入靶物催化发卡结构组装作为循环信号放大方法,构建了一种用于检测单链DNA的高灵敏荧光检测平台.通过对实验条件进行优化,确定以氧化石墨烯浓度60 mg/mL、加入target DNA后反应温度37℃、反应时间30 min为该检测方法的最佳反应条件.在优化后的实验条件下,加入靶物DNA后荧光信号变化值与靶物浓度的线性范围为0.5~14 pM,检测限为0.055 pM.该检测方法快速、灵敏、成本低,通过改变荧光探针序列还可实现micro RNA、生物小分子和蛋白质的检测,因此在生化分析和分子医学等领域具有较大的应用前景.

特异性针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因SiRNA表达载体的构建、鉴定及对高糖状态下INS-1细胞周期的影响

目的构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响。方法根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro-GFP/Neo,并用RT-PCR和测序鉴定,将其转染至INS-1细胞中,Westernblotting观察PTH1R表达,鉴定其转染效率,筛选出最佳抑制基因后,应用流式细胞仪检测25mmol/LD-葡萄糖处理INS-1细胞周期。结果菌落RT-PCR及基因测序鉴定结果表明序列正确。并能成功转染到INS-1细胞株中,Westernblot筛选最佳抑制基因。细胞周期检测提示PTH1R沉默后抑制INS-1细胞从G0/G1期进入S期。结论成功构建并筛选出特异性沉默大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体,高糖状态下PTH1R表达可能为INS-1细胞自我保护的一种作用。

T-bet基因shRNA真核表达载体的构建及其功能的初步研究

目的:构建靶向Th1细胞特异性转录因子T-bet的小发卡结构RNA(shRNA)的真核表达载体,并评价其功能,为开展T-bet相关性疾病的免疫干预研究奠定基础。方法:设计并合成靶向T-bet的shRNA序列,构建真核表达载体,并转染DC2.4细胞;MTT法检测转染后DC2.4细胞增殖能力,用RealtimePCR和Westernblot分别从基因及蛋白水平检测转染前后DC2.4细胞T-bet表达水平变化;RealtimePCR检测IFN-γ的mRNA;流式细胞术(FCM)检测细胞表面CD80、CD86与MHCⅡ类分子表达情况。结果:构建的T-bet靶向shRNA真核表达载体,能够显著抑制DC2.4细胞T-bet的表达,且转染后DC2.4细胞增殖受到抑制,CD80、CD86及MHCⅡ类分子表达下调,IFN-γmRNA水平显著下降。结论:成功地构建了T-betshRNA真核表达载体,转染DC2.4细胞后能有效地抑制其T-bet、IFN-γ的表达,影响其抗原提呈功能。

靶向呼吸道合胞病毒M2基因pshRNA载体质粒的构建及意义

目的:构建针对呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因m RNA的短发卡结构状RNA(shRNA)重组载体质粒,为利用RNA干扰技术抗RSV感染的深入研究奠定基础;方法:按shRNA设计原则,选择RSV-M 2基因作为靶基因,设计19bp长的能产生短发卡结构的两段DNA反向重复序列,中间以9bp序列间隔,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上,重组质粒经酶切和测序鉴定,然后将构建成功的重组质粒转染H EP2细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞发生率以评估转染效率。结果:将设计合成的DNA片段成功克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列,并且荧光显微镜下观察细胞有较多的绿色荧光蛋白表达。结论:成功构建了针对RSV M 2基因m RNA的shRNA重组载体质粒,可利用重组质粒进一步研究其对RSV感染的抑制,从而为抑制RSV感染寻找新的基因治疗手段。

外壳蛋白基因片段介导的高抗TuMV研究

为了获得对芜菁花叶病毒(TuMV)高度稳定的抗性,选取TuMV的外壳蛋白(CP)基因近3'端保守区共377 bp的核苷酸序列,构建了抗TuMV的发卡结构RNAi载体,并转化了TuMV的天然宿主拟南芥。转基因植株用北京地区TuMV主要流行的强致病株系BJ-C4人工接种。鉴定的8个转基因株系中有3个株系表现出对TuMV的高度抗性。定量PCR结果显示,高抗转基因株系体内几乎检测不到病毒的积累。

STAT1特异性siRNA真核表达载体的构建及体外转染优化

目的:构建STAT1特异性siRNA真核表达载体,并转染人气道上皮细胞(16HBE)。方法:根据GeneBank数据库提供的STAT1基因两种变异体的共同核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链siRNA,再转化为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)的DNA序列,并将其连接到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的pGenesil-1.1真核表达载体上,将其转染至气道上皮(16HBE)细胞中,观察荧光表达,鉴定其转染效率。结果:通过酶切鉴定和序列测定,成功地构建了二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到(16HBE)细胞株中,质粒/脂质体为1μg:2μl条件,能有效地转染细胞,转染效率达到50%以上。结论:成功构建siRNA真核表达载体并能成功体外转染,为下一步气道炎症性疾病的基因沉默研究奠定了良好的基础。

shRNA干扰HERG钾通道治疗裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤

目的:探讨发卡结构小片段RNA(small hairpin interfering RNA,shRNA)干扰人ERG(human ether-α-go-go-related gene,HERG)钾通道治疗裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤的疗效和作用机制。方法:用真核转录载体mU6pro构建针对herg基因的发卡状RNA干扰质粒(shRNA-herg)。18只BALB/c裸小鼠皮下接种成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤模型,当瘤体积达到100mm3时随机分成3组,分别为生理盐水组(Ⅰ)、对照质粒组(Ⅱ)、干扰质粒组(Ⅲ)。各组瘤内分别注射生理盐水、对照质粒、干扰质粒,以后每7d注射1次,连续15d。观察各组肿瘤生长情况,RT-PCR测定肿瘤组织herg基因mRNA含量变化,免疫组化检测肿瘤组织中HERG钾通道蛋白变化。结果:经治疗后,第Ⅲ组肿瘤生长受到明显抑制,Ⅱ、Ⅲ组抑瘤率分别为3.04%和29.78%(P<0.05)。肿瘤组织内herg基因mRNA含量、HERG钾通道蛋白,Ⅲ组较Ⅰ、Ⅱ组表达减弱。结论:构建的shRNA干扰质粒可通过靶向性抑制herg基因及其编码的HERG钾通道蛋白的表达,有效地抑制人成神经细胞瘤的生长。

Survivin特异性siRNA真核表达载体的构建

目的构建Survivin特异性siRNA真核表达载体,为以Survivin基因为靶点、小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)为手段的白血病和其它恶性肿瘤基因治疗的基础和临床应用提供良好的技术手段。方法根据GeneBank数据库提供的Survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链siRNA,再转化为能表达其小发卡结构RNA(small hairpinRNA,shRNA)的DNA序列,并与载体pSINsi-hU6定向连接,构建受控于启动子U6的真核表达载体pSIN/shRNA1、pSIN/shR-NA2,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果构建Survivin特异性siRNA真核表达载体pSIN/shRNA1、pSIN/shR-NA2,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论Survivin特异性siRNA真核表达载体构建成功。

NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。

利用荧光寿命变化定量分子内和分子间相互作用的方法

荧光寿命是指荧光分子在回到基态前在激发态停留的平均时间.本文发展了基于荧光寿命测量来定量分子内和分子间相互作用的方法:通过G碱基猝灭对于荧光寿命的影响定量DNA二级结构的形成;通过荧光共振能量传递(FRET)中荧光寿命的变化来定量分子间的相互作用.第一种方法巧妙利用了G碱基会猝灭临近的染料分子的性质,结合荧光寿命的变化,可以判断DNA二级结构的形成以及形成的比率.FRET是用于研究生物分子相互作用的一个重要手段.传统的FRET方法主要是基于强度的变化,但这种变化容易受到荧光表达水平变动、样品中分子扩散以及荧光串色的影响,因此经常存在着实验比较复杂和重复性差的问题.而基于荧光寿命的FRET研究则可以很好地克服上述缺点.通过检测供体荧光寿命的变化,我们能够方便快捷地判断是否发生FRET,并通过建立系统的数据分析方法,得到FRET的效率以及分子之间相互作用的信息.

Thermus aquaticus DNA连接酶的连接特性研究

为进一步研究Thermus aquaticus（Taq）DNA连接酶的作用机理、开发以DNA连接作为关键步骤的新生物技术,本文以含有超稳定发卡结构的DNA（带有11nt长的单链部分）和另一条单链DNA为连接底物,研究了片段长度、反应温度、连接位点的结构特性、聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）的添加等对连接的影响,探讨了Taq DNA连接酶的连接特性。连接结果显示：单链DNA的3’端同发卡结构I底物相连的连接率,比单链DNA的5’端同发卡结构II底物相连的连接率更高;可以连接的最短单链DNA片段的长度为6nt;在20～65℃范围内,一般连接率随温度升高而升高。在连接时,由2条底物通过互补配对形成的复合体的热稳定性对连接率影响不大,一般在连接温度远远高于该复合体的熔点（Melting Temperature,Tm）时仍有很高的连接率。在70或75℃时,虽然连接率有所降低,但仍然可以连接9nt的单链DNA片段。研究还发现,在片段连接上,PEG 6000对较难连接的片段（6～7nt）有促进作用,对容易连接的片段（8～10nt）促进作用不显著,甚至有一定抑制作用。

反向重复序列DNA的PCR扩增特性研究

旨在研究反向重复序列形成的发卡结构对模板扩增的影响。研究DNA发卡结构中环部大小、茎部长度、引物相对于茎部位置等对PCR扩增效率的影响,探讨如何通过引物设计及改变退火温度等条件来实现发卡结构DNA的有效扩增的方法。结果显示,如果引物的位置同发卡结构茎部5'序列相同或部分相同,则由于发卡结构的形成阻碍引物与模板结合而对PCR产生抑制作用,并且抑制作用随着茎部长度的增加而增强;当环部的长度达到50 nt以上时,抑制作用明显减弱。较高的退火温度和引物浓度都有助于引物同分子内形成发卡结构的竞争,使PCR扩增更容易进行。

miRNA在结直肠癌中的研究现状

MicroRNA（微小RNA,miRNA）是一类大小约19-25nt的短链非编码RNA,人类已发现1000多种miRNA,参与调节了人60%以上的人类基因[1]。MiRNA由RNA polymeraseⅡ转录成较长的初级产物pri-miRNA,然后在Drosha和DGCR8酶的作用下,剪切为约70nt并具有独特发卡结构的premiRNA,

高灵敏靶标自环化滚环扩增检测的动态接头构建

针对靶标自环化滚环扩增(TC-RCA)难以高灵敏度检测的难题,本文探究了扩增过程中靶标环化效率低的原因,并构建了新型动态接头以提高靶标DNA的环化灵敏度。通过采用含有发卡结构的动态接头(18 nt),使接头的两端产生连接活性差异,探讨发卡接头打开与闭合的动态平衡在提高环化灵敏度中的作用。具体研究了发卡动态接头的稳定性和磷酸化对连接及环化效率的影响。研究表明,增加接头两端的连接活性差异可提高环化灵敏度(106 copies/μL),从而揭示了TC-RCA灵敏度低的根本原因。由于许多过量的接头同时连接到靶标DNA两端后,靶标无法环化,造成仅有少部分靶标环化为RCA模板,导致极低浓度的靶标无法发生RCA。在此基础上,采用另一种10 nt的短链动态接头,使检测灵敏度提高了两个数量级(达104 copies/μL)。本研究为TC-RCA中接头的设计提供了新思路,对双链DNA环化机理的深入研究具有重要意义。