催化发夹自组装技术用于miRNA检测的研究进展

微RNA (microRNA, miRNA)是一类小分子RNA,参与了众多的细胞过程,在生命体的生长发育过程中起到了关键作用。鉴于miRNA的重要性和结构特殊性,其对于疾病的预测与评估有着深刻的意义。当前,miRNA检测技术迅猛发展,其中,催化发夹自组装(catalytic hairpin assembly, CHA)是一项新型核酸恒温扩增技术,具有反应过程无需酶催化、检测灵敏度高特异性强、操作简单方便等优点,在miRNA的检测领域有着巨大潜力。本文将着重阐述CHA技术的检测原理,从靶标识别、信号扩增、信号输出3个方面对基于CHA技术的miRNA检测策略进行介绍,并提出该技术当前面临的挑战及前景,旨在为医学、生物信息等相关领域的研究提供进一步参考。

哺乳动物细胞中mRNA起始密码子附近的发夹元件对基因表达的调控

本文开发了一种位于起始密码子附近的发夹元件以在哺乳动物细胞中调节mRNA的表达水平.研究了发夹元件的热力学稳定性、GC含量、与5'帽的距离等参数对mRNA表达的影响.此外,隐藏在发夹元件内的起始密码子和上游开放阅读框也会削弱mRNA的翻译起始.证明了此简单的工程化发夹结构可以有效地用于可控的mRNA翻译调控,有利于在不同类型哺乳动物细胞中实现可预测的基因调控.

EIF4A3 shRNA慢病毒载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索EIF4A3基因序列,设计并合成PCR鉴定引物,并将其连接至经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒GV493载体,构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒质粒,PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。将GV493空载质粒和GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为GV493对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为空白组、GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组,空白组不作处理,GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组分别采用相应慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,使用10 mg·L-1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞的生长状态和绿色荧光表达情况;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中EIF4A3 mRNA及蛋白表达水平。结果:PCR测序结果显示GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒基因序列与设计合成的EIF4A3-shRNA序列一致,成功构建GV493-EIF4A3慢病毒载体。荧光显微镜观察可见HEK293T细胞荧光表达强烈,生长状态良好,慢病毒包装成功。GV493-对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒的滴度均为2×10~8 TU·mL^(-1),GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞生长状态良好且表达绿色荧光,表明慢病毒感染稳定细胞系构建成功。RT-qPCR法,与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3shRNA组Neuro-2a细胞EIF4A3mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。Western blotting法,各组在相对分子质量49000处出现特异性条带,提示Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达成功;与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:成功构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒载体,建立了Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系,为EIF4A3在颅内动脉粥样硬化的作用机制研究提供了参考。

甘蓝型油菜三种种子储藏蛋白和丙酮酸羧化酶基因片段的克隆及hpRNA表达载体的构建

利用PCR从甘蓝型油菜(Brassica napusL.)华双4号基因组DNA中扩增出种子储藏蛋白cruc iferin、nap-in、oleosin和丙酮酸羧化酶(PEPC)基因片段,再以扩增出的片段为模板设计引物从一端扩增出4个相应的小片段,然后将同一基因的大小两个片段反向连接,插入到种子特异表达载体2300-nap多克隆位点的nap in启动子和nos终止子之间,构建成可以在油菜种子中转录表达发夹RNA(Hairp in RNA,hpRNA)结构的植物表达载体。

甘蓝型油菜依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段克隆及hpRNAi载体构建

依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径的关键酶。本研究首先构建带有种子特异性napin启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-nap及带有组成型35S启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-35S;然后用PCR法从甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)中油119总基因组中扩增出依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段,再以扩增出的PFK基因片段作模板设计引物扩增出一个相应的小片段。将两个PFK基因片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpinRNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜RNA干扰载体,为今后油菜利用RNA干扰(RNAi)提高含油量的基因工程研究奠定了基础。

短发夹RNA介导RNA干扰的时间和剂量效应研究

用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术抑制哺乳动物细胞中外源报告基因的表达,以探讨该过程中RNAi作用的剂量和时间效应.应用Lipofectamine 2000将外源报告基因的表达载体与编码短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA)的质粒共转染HEK293H细胞,观察shRNA载体对报告基因的抑制效应.转染后,shRNAs的瞬时表达可特异地抑制细胞内报告基因的表达.在共转染后12,24,48,60,72,96 h时检测EGFP(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因mRNA及蛋白质表达水平,结果显示,EGFPmRNA及蛋白质表达在12 h时略有降低,24～48 h时表达逐渐降低,48～72 h时降低最明显,其后EGFP表达水平逐渐恢复.提示该过程中RNAi效应呈现由弱到强、又由强到弱的逐渐消逝趋势.共转染一系列剂量比例的EGFP干扰载体与靶载体的结果表明,在一定剂量范围内,RNA干扰载体所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关,当其剂量进一步加大足以抑制外源基因表达时,抑制效应则维持在一'平台期'.此外,通过RNAi抑制HeLa细胞、HEK293细胞中荧光素酶基因的表达,荧光素酶活性变化也表现出上述类似的效应.这些结果表明,在体外哺乳动物细胞中,基于表达载体的RNAi作用呈现剂量和时间依赖性效应.这为基于载体表达的RNAi技术应用研究提供了一定的理论参考及依据.

甘蓝型油菜乙醇酸氧化酶(GO)基因片段的克隆及hpRNA表达载体构建

通过PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus)华双4号基因组DNA中扩增出乙醇酸氧化酶(GO)基因片段,DNA序列分析表明扩增GO基因片段的外显子部分与报道序列相同.以扩增出的GO基因片段作模板从一端设计引物扩增出一个相应的小片段.将GO基因大小两个片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜hpRNA干扰载体.

转病毒来源发夹RNA小麦表现对大麦黄矮病毒的抗性

将大麦黄矮病毒GPV株系的复制酶基因片段和CP基因片段构建成可在植物细胞内表达含有双链复制酶RNA(茎)和反义CPRNA(环)的复合发夹RNA结构,希望能够诱发植物体针对病毒的RNA干扰作用,从而达到抗病毒目的。利用基因枪法将该结构导入小麦幼胚愈伤组织细胞后,通过在幼苗再生阶段进行以叶片为模板的快速PCR来加速阳性植株的筛选过程,最终共获得基因组整合有外源基因的小麦再生植株21株。对再生植株接种不同剂量的病毒,其中9株对BYDV-GPV有低度抗性,表现在低接毒量时无症状,接毒量提高时发病且严重;6株具中度抗性,表现在低接毒量时无症状,接毒量提高时局部有不严重症状;6株具高度抗性,两种情况下均无症状。抗性实验结果表明,hpRNA介导对BYDV的抗性可能受到BYDV含量的影响,具有剂量效应的特点。

短发夹RNA沉默hTERT基因对人喉癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用

背景与目的:RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指双链RNA导入细胞后诱导靶mRNA发生特异性的降解,导致基因转录后沉默的现象。RNAi在基因功能和抗病毒基因治疗等方面均有报道。但对喉癌等头颈恶性肿瘤中高表达的人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)基因,目前尚未见报道。本课题利用RNAi技术,研究短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)抑制hTERT基因表达对裸鼠喉鳞状细胞癌皮下移植模型的抑瘤作用。方法:根据hTERTcDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA。建立人喉癌Hep-2细胞株裸鼠皮下接种模型。将pshRNA转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况。以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤组织内的表达;以HE染色法观察质粒治疗后瘤组织的病理改变;以原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况;以免疫组化SP法检测hTERT蛋白在肿瘤内的表达;光镜下观察心、肝、肾、脾结构的改变并测量血液学和血液生化指标。结果:pshRNA组(A组)、空质粒载体组(B组)与生理盐水组(C组)之间比较,A组与C组瘤体积有显著性差异(P<0.01),B组与C组之间瘤体积无显著性差异(P>0.05),抑瘤率为76.50%。pshRNA及空质粒载体转染入瘤体后,共聚焦显微镜下见大量的癌细胞表达绿色荧光。病理学检查及TUNEL检测发现:A组肿瘤生长受到抑制,细胞分裂相少见,可见大量肿瘤细胞坏死及凋亡,该组肿瘤细胞的凋亡指数[(26.47±4.25)%]明显高于B组[(3.40±1.41)%]和C组[(2.73±1.35)%]。给予pshRNA后瘤体内hTERT蛋白表达明显下调,而且对心、肝、肾、脾无明显损害,对造血系统无影响。结论:表达shRNA的DNA载体质粒沉默hTERT基因可显著抑制人喉癌裸鼠肿瘤的生长,而且对心、肝、肾、脾及造血系统无明显的毒副作用。

bcl-x_L短发夹状RNA诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡(英文)

背景与目的:实验证明bcl-xL 在鼻咽癌细胞株CNE-2Z 中存在高表达,它可能在鼻咽癌的发生发展、转移及治疗过程中产生耐药等方面发挥重要作用。本研究拟探讨bcl-xL 短发夹状RNA (shorthairpin RNA ,shRNA )诱导CNE-2Z 细胞凋亡的作用。方法:把表达bcl-xL shRNA 的重组质粒pm U6-RNAi转染到CNE-2Z细胞中,用荧光染色和流式细胞术等方法检测细胞凋亡;用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polym erase chain reaction,RT-PCR )检测bcl-xL、bcl-2、survivin和caspase-3的m RNA 表达水平;用W estern blot检测Bcl-xL、Caspase-3和P53的蛋白表达水平。结果:流式细胞术检测发现,pm U6-RNAi重组质粒作用24h 后,细胞出现明显的凋亡峰;H oechst33258单染在荧光显微镜下可见细胞缩小、染色质固缩和核断裂;RT-PCR 分析pm U6-RNAi重组质粒作用细胞后明显下调了bcl-xL、bcl-2和caspase-3的m RNA 表达水平, 对survivin 的m RNA 表达水平无影响;W estern blot分析pm U6-RNAi质粒作用细胞后明显下调了Bcl-xL、Caspase-3的蛋白表达水平,而大幅度上调了P53的蛋白表达水平。结论:bcl-xL shRNA 可诱导CNE-2Z 细胞凋亡;CNE-2Z 细胞的凋亡可能与bcl-2、caspase-3和p53有着密切的关系;质粒表达的bcl-xL shRNA

短发夹结构RNA干扰新城疫病毒的增殖

以新城疫病毒(NDV)NP基因为标靶,构建3个细胞内表达发夹样结构小干扰RNA(shRNA)的质粒载体,在鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚上进行了RNAi试验,筛选出一个有效抑制病毒复制的小分子ndv1.用阳离子脂质体转染试剂Silent-fect将ndv1转染CEF,以不相关shRNA质粒载体HK为阴性对照,4h后接种NDV,与对照相比,干涉组在病毒感染后3hNP基因的表达量降低2.3倍,6h降低21.1倍,9h降低9.8倍;ndv1能在48h内完全阻断NDV在CEF中的增殖,延缓病变出现时间,减轻病变程度.将Silent-fect-ndv1混合物与NDV同时注入10日龄SPF鸡胚绒毛尿囊腔,能使105ELD50NDV感染后17h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少94.4%,使106ELD50 NDV感染后17h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少62.5%.实验结果证实,在CEF中存在RNAi机制,抑制ND VNP基因的表达能有效阻断该病毒增殖,说明NP基因在NDV复制过程中起重要作用.实验结果为进一步利用RNAi技术在CEF和鸡胚中研究病毒基因组功能及筛选抗病毒小分子奠定了基础.

血管紧张素Ⅱ1型受体短发夹环RNA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :RNA干扰 (RNAi)是一种新的高效特异地阻断基因表达的基因阻断技术。本研究旨在探讨血管紧张素Ⅱ 1型受体 (AT1R)的短发夹环RNA质粒 (pAT1R shRNA)对大鼠血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的影响。 方法 :构建pAT1R shRNA质粒 ,并转染入鼠VSMC中 ,应用RT PCR及Westernblot检测血管平滑肌细胞AT1R的mRNA和蛋白表达的变化 ,验证 pAT1R shRNA是否具有RNAi作用 ;应用台盼蓝染色法和MTT法检测VSMC增殖情况。结果 :构建的质粒 pAT1R shRNA经测序鉴定验证与预期相符。转染组AT1R的mRNA和蛋白表达明显减少 ,与对照组相比有显著性差异 (P <0 .0 1) ;转染质粒同时加AngⅡ刺激的VSMC增生明显受到抑制 ,与对照组相比有显著性差异 (P <0 .0 1)。结论 :构建的pAT1R shRNA质粒具有RNAi作用 。

MDR1短发夹RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究

目的 构建在哺乳动物细胞中表达MDR1短发夹RNA(shorthairpinRNA ,shRNA)的表达质粒 ,并初步探讨其对耐药肝癌细胞MDR1mRNA的抑制作用及抗肿瘤药物耐药性的影响。方法 根据Genbank中MDR1mRNA设计的两条多聚核苷酸序列 ,退火形成双链DNA ,再与经双酶切后的载体PGE 1连接 ,构建 pshRNA MDR1重组质粒 ,在脂质体的介导下转染肝癌细胞株BEL 74 0 2 /ADM ,RT PCR分析MDR1mRNA的表达 ,MTT法检测阿霉素对细胞的半数抑制浓度 (IC50 )。结果 PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功 ,并能明显地抑制BEL 74 0 2 /ADMMDR1mRNA的表达 ,对阿霉素的耐药指数降低了17.5倍 ( 2 99.2 / 17.1)。结论 构建的 pshRNA MDR1表达质粒能有效地抑制转染细胞MDR1mRNA ,从而提高肿瘤细胞的药物敏感性。

survivin短发夹状RNA真核表达载体的构建及其对宫颈癌细胞survivin表达的影响

目的:构建survivin基因短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其对宫颈癌细胞survivin表达的抑制作用。方法:设计、合成2对survivin特异性微小片段RNA引物(s1、s2),退火连接后利用DNA重组技术,将其分别克隆入真核表达载体pSilencer 2.1-U6 neo,酶切、鉴定测序后,经脂质体转染宫颈癌HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,半定量RT-PCR检测survivin mRNA表达,Western blot检测survivin蛋白表达。结果:成功构建了survivin shRNA真核表达载体pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2,G418筛选24 d后出现阳性克隆,转染pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2的HeLa细胞中,survivin表达呈现不同程度下调,pSilencer2.1-s2的干涉效果较好。结论:成功构建并筛选出干涉效果较好的survivin shRNA真核表达载体,为进一步研究其对宫颈癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。

核干细胞因子特异性短发夹状RNA对HL-60细胞分化抗原和生物学性质的影响

目的研究核干细胞因子(nuc leostem in,NS)特异性短发夹状RNA(shRNA)阻断NS基因表达对HL-60白血病细胞分化抗原及生物学性质的影响,探讨NS的生物学功能和与急性白血病的关系以及用于基因治疗的可能性。方法特异性转染试剂和合成的NS短发夹状RNA(NS-shRNA)体外直接转染HL-60细胞,采用RT-PCR判断基因阻断效果,MTT法测定转染后细胞增殖能力,流式细胞仪(FCM)测定细胞分化抗原,形态学观察细胞形状和生长状态,血细胞分析仪测定细胞大小、粒度。结果合成的2条NS-shRNA均能明显阻断NS基因表达,抑制率分别为37.82%和71.88%;NS-shRNA能显著抑制HL-60细胞的增殖并存在时间和浓度依赖性,以48 h和10 nmol/L浓度最佳。转染后:分化抗原CD11b、CD33、CD14、CD64、HLA-DR增高,CD38降低,显示有向粒系继续成熟和向单核系重新分化趋势;细胞聚团性减弱,碎片增多,一部分细胞形态变成梭形和长尾形,染色后细胞核紧密,凹陷,髓过氧化物酶(MPO)和α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)活性增强;大小和粒度分析小体积细胞和核碎裂细胞增多。结论NS-shRNA通过阻断NS基因表达,对HL-60细胞有抑制增殖和促分化作用,改变了细胞的生物学性质,使细胞恶性程度有所减弱,并有可能诱发凋亡,在白血病的基因中具有潜在的临床价值。

甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDⅢ克隆及其hpRNA载体构建

【目的】克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建其hpRNA表达载体,为研究该基因生物学功能奠定基础。【方法】通过同源克隆获得甘蔗SofSPSDⅢ基因部分序列,利用RACE技术获得其全长cDNA。扩增SofSPSDⅢ目的基因约500 bp序列,利用中间载体pHANNIBAL构建该片段的hpRNA结构,然后用Not Ⅰ将整个hpRNA结构切下,克隆到双元植物表达载体pART27上,构建该基因的hpRNA表达载体。【结果】通过同源克隆和RACE技术获得SofSPSDⅢ基因全长cDNA序列,该基因全长3252 bp,5′端UTR长度59 bp,3′端UTR长度292 bp,开放阅读框(ORF)长度2895 bp,带有真核生物典型的poly(A)尾巴(GenBank登录号:HQ117935)。该基因编码蛋白含有964个氨基酸,理论分子量108.03kDa,等电点pI=6.66;SofSPSDⅢ与SoSPS2、SbSPS和TaSPS9的氨基酸序列同源性分别为99.0%、98.9%和90.0%。构建获得SofSPSDⅢ基因的hpRNA载体pART-DⅢ-Ri。【结论】成功克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建基hpRNA载体,可为下一步沉默该基因、进而解析该基因的生物学功能奠定基础。

短发夹状RNA在人细胞诱导RNA干扰(英文)

背景与目的:RNA干扰是一种通过细胞内导入双链RNA而导致特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前RNA干扰已成为研究基因功能的重要方法。本研究旨在利用DNA载体在细胞内产生短发夹状RNA(shorthairpinRNAs,shRNA),通过这些shRNA来诱导RNA干扰(RNAinterference,RNAi),为基因功能分析提供新的实验手段。方法:利用双荧光素酶报告系统来检测DNA载体在细胞内产生的shRNA诱导RNAi的效果。比较该载体产生的shRNA在不同条件下的RNA干扰效果。结果:DNA载体产生的shRNA在人细胞能诱导RNAi,序列特异地抑制基因表达。抑制效果与所选基因靶位点高度相关。结论:shRNA在人细胞能诱导RNA干扰,序列特异地抑制基因表达,这一方法可用于基因功能分析。

Nucleostemin基因特异性短发夹状干扰RNA在裸鼠移植瘤模型体内的抗白血病作用

目的探讨核干细胞因子(NS)特异性短发夹状干扰RNA(NS-shRNA)在裸鼠移植瘤模型体内的抗白血病作用。方法对数生长期HL-60细胞接种于裸鼠皮下使其致瘤并洗脱,体外传至第5代再次接种裸鼠,Transwell法验证HL-60细胞体外侵袭力,建立高致瘤性HL-60白血病细胞异种移植瘤裸鼠模型。腹腔注射体外合成的NS-shRNA脂质包裹体,观察治疗前后瘤体体积、重量的变化,组织切片、HE染色观察肿瘤细胞学改变,免疫组织化学检测瘤体细胞内NS蛋白含量,TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(Tunel)检测细胞凋亡情况。结果制备的高致瘤性HL-60细胞使30只裸鼠均形成异种移植瘤,成瘤率为100%,瘤体大小均一。腹腔注射NS-shRNA脂质包裹体13天后,治疗组裸鼠移植瘤体积增长率为207.1%,阴性和空白对照组分别为497.1%和569.6%。治疗组瘤体重量为(1.18±0.27)g,阴性和空白对照组为(2.04±0.73)g和(2.35±0.41)g。切片观察治疗组有大量斑片状组织结构破坏,并出现"凋亡特征"样细胞改变。免疫组织化学检测治疗组移植瘤细胞NS蛋白阳性率和积分值分别为(71.59±1.80)%和(110.26±13.46),阴性对照组为(90.72±1.47)%和(195.11±9.71),空白对照组为(97.33±1.76)%和(220.93±16.54),与阴性和空白对照组相比,NS蛋白表达抑制率分别为43.5%和50.1%。Tunel法检测治疗组移植瘤内出现较多凋亡细胞。结论 NS-shRNA在裸鼠移植瘤模型体内具有抗白血病作用,其作用机制之一可能是通过下调NS表达诱发白血病细胞凋亡增加。

Smad4/DPC4基因小发夹RNA质粒表达载体的构建和鉴定

目的:构建Smad4基因小发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计、合成3对编码Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列,并分别将其克隆入pGCsi-H1/Neo/GFP质粒,酶切、测序鉴定,脂质体法转染293细胞。实时荧光定量PCR检测RNA干扰(RNA i)的抑制效果。结果:在经HindⅢ和BamHⅠ双酶切分别鉴定三种重组载体后,DNA测序证实小干扰RNA(siRNA)序列正确,并被准确克隆入载体。实时荧光定量PCR检测结果表明三种重组载体psiSm ad4-1、psiSm ad4-2和psiSm ad4-3载体,分别对293细胞中Smad4基因mRNA表达的特异性抑制率为39.00%、8.80%和73.80%。结论:成功构建Sm ad 4 pGCsi-H1/Neo/GFP/shRNA质粒,为后期研究Smad4基因在肿瘤细胞中的作用机制和基因治疗打下基础。

T7启动子介导体外构建Nucleostem in特异性短发夹状干扰RNA

目的体外构建合成针对Nuc leostem in(核干细胞因子,NS)基因的短发夹状干扰RNA(shRNA),用于进一步研究以该基因为靶目标、RNA干扰(RNA interference,RNA i)为手段的白血病基因治疗可行性。方法从Nuc leostem in基因的三个变异体cDNA共同序列中筛选出2个3′端为AA的21个碱基片段作为shRNA合成的对应序列,9个碱基的5′-UCUCUUGAA-3′作为Loop环。以23个碱基的5-′GGATC-CTAATACGACTCACTATA-3′作为T7启动子(T7 Promoter)序列,构建shRNA的体外合成双链DNA模板,一条链5′端无AA,顺序为启动子、shRNA正义信息链、Loop环、shRNA反义信息链,共70个碱基;另一条是该链的互补链,5′端带有AA,共72个碱基。在T7 RNA聚合酶(T7 RNA polym erase)作用下合成shRNA,纯化后通过凝胶电泳比较灰度值确定shRNA浓度;shRNA作用于HL-60细胞,通过观察细胞形态变化和NS-mRNA抑制率验证干扰效果。结果体外合成的两条shRNA电泳无降解和弥散现象,浓度分别为5.24μmol.L-1和3.35μmol.L-1;干扰HL-60细胞48 h后,细胞密度和聚集程度下降,细胞之间大小相差悬殊,经shRNA-NS-2作用的HL-60细胞一部分由圆形变成了梭形并有明显的伪足;与对照组相比NS-mRNA抑制率分别达到37.82%和71.88%。结论体外成功构建和合成了两条针对Nu-c leostem in基因的shRNA,且抑制该基因表达的作用明显,shRNA-NS-2使HL-60细胞形态发生了改变。所合成的shR-NA-NS-2可作为进一步研究该基因和探索白血病的基因治疗的工具。