基于绿豆发状根的快速CRISPR/Cas9基因编辑方法

由于缺乏有效稳定的遗传转化体系,导致基因编辑技术在绿豆中的应用受到极大限制,也使绿豆基因功能研究受到极大阻碍。因此,建立一套基于发根农杆菌的操作简便、快速且高效的绿豆嵌合植株转化技术,可以为绿豆基因功能研究提供技术支撑。首先在CRISPR/Cas9载体骨架中插入1个绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达框用于阳性发状根的快速筛选,然后将含有靶标基因gRNA的CRISPR/Cas9质粒导入发根农杆菌K599。菌液注射侵染绿豆幼苗植株下胚轴,评价K599在绿豆中诱导发状根发生及CRISPR/Cas9系统在绿豆转基因发状根组织中的效率。结果显示,K599菌液侵染种植7 d的绿豆幼苗植株并在保湿条件下培养3周可在侵染点诱导发状根产生,此嵌合植株在切除原生根后可在霍格兰培养液中正常生长且培养1周后即可用于后续检测。用GFP筛选的结果显示,阳性发状根占比约为(57.8±10.0)%。随机选择15个荧光检测阳性的转基因发状根组织,利用测序检测靶位点的编辑效果,结果显示有10个靶位点的序列发生了突变,突变比例达到67%,其中碱基缺失突变9个,碱基转换突变1个。由本研究结果可知,利用该方法可以在无菌组织培养的条件下于4周内获得目的基因编辑的转基因组织,极大地便利了绿豆分子水平上的功能研究,也为其他尚缺乏稳定遗传转化体系的作物进行基因功能研究提供了参考。

农杆菌转化的小冠花发状根的诱导及其植株再生

利用野生型发根农杆菌15834菌株感染小冠花15日龄无菌苗子叶和下胚轴切段,建立了高效的发状根培养及其体细胞胚胎发生再生体系。发状根可直接从受伤的外植体表面产生,也能在外植体诱导的愈伤组织上发生,在无外源激素的MS固体和液体培养基上,转化根能自主生长,表现出典型的发根特征。用适宜浓度的乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液2h,感染预培养2d的子叶获得了最高的转化频率(87.4%)。在附加0.2mgL2,4_D,0.5mgLNAA和0.5mgLKT的MS培养基上,发状根能100%形成胚性愈伤组织,并于含0.5mgLKT,0.2mgLIBA和300mgL脯氨酸的MS培养基上顺序经过体细胞胚胎发育的各个典型时期,转换成完整植株。再生植株除具有发达的侧根外,其它形态特征与未转化植株未见明显的差异,但在获得的5个转化克隆中,其中1个的发状根及其再生植株叶片中有毒物质3_硝基丙酸的含量显著下降,分别为未转化对照的57.68%和58.17%。冠瘿碱纸电泳检测和rolB基因PCR扩增检测均证明农杆菌Ri质粒上的T_DNA已经整合到小冠花转化细胞的基因组中。

茶树根愈伤组织及发状根诱导的研究

为了获得茶树发状根,生产茶叶中的有用物质,以大田茶树的根为材料,在离体培养下对其诱导发状根.结果表明,从茶树根愈伤组织中诱导出的发状根具有生长快、无向地性、密生白色根毛和较强的分枝能力.发状根分枝,存在直接分枝和在发状根上出现瘤状突起后在其附近发生侧根2种类型.发状根及其愈伤组织轮换在不同组分的培养基上继代培养,对发状根的分化与增殖有明显的促进作用.根外植体在本研究的所有培养基上都诱导出了愈伤组织,不同品种的根外植体愈伤组织诱导率存在明显差异.

光照和植物生长物质对宁夏枸杞正常根和发状根离体生长的影响

目的:探索光照和植物生长物质对宁夏枸杞无菌苗正常根和发状根离体生长的影响,建立离体根的最佳培养体系。方法:以宁夏枸杞无菌苗正常根和发根农杆菌A4诱导叶外植体再生的发状根为材料,观察根切段在光照、植物生长物质种类和含量等不同的培养条件下的生长(长长、侧根形成)情况。结果与结论:MS培养基中添加植物生长物质(IAA,IBA,NAA)能够诱导宁夏枸杞正常根切段的生长和分枝形成,而1 mg.L-1IBA的存在最适合于正常根的长期离体培养。在无激素培养基上,光照能促进Ⅱ型发状根的长度增长和分枝侧根,却不利于Ⅰ型发状根的生长。在添加的3种外源植物生长物质(IAA,IBA,NAA)中,低含量的IAA更适合于Ⅰ型发状根的增长培养;而在促进Ⅱ型发状根的增长和侧根形成方面,1 mg.L-1IBA的作用最强。随着植物生长物质添加含量的增加,Ⅱ型发状根的愈伤组织化程度也加大,同时也抑制了从发状根或其形成的愈伤组织上形成新的分枝侧根。

金荞麦发状根培养的研究

金荞麦(Fagopyrum cymosum(Trev.)Meisn]无菌苗经发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)感染后诱导出发状根。发状根在液体培养条件下的增殖速度显著高于细胞培养物,培养25天增殖1861倍,而细胞培养物仅增殖26.7倍。发状根培养物积累有效成分(双聚原矢车菊甙元)稳定,接近原植物的水平,最高含量达4.5%(干重)(培养40天)。发状根培养物也适于大量培养,增殖率达149.3mg 干重/L/天。有效成分含量为3.58%(干重)。

发根农杆菌A_4转化黄瓜获得发状根再生植株

研究以黄瓜 ( Cucumis stativus)栽培品种津研四号为试材 ,比较了培养基中添加激素对自然生根及发状根诱导的影响 .无菌苗子叶及下胚轴经发根农杆菌 ( Agrobacterium rhizogenes) A4 侵染后 2周诱导出发状根 ,发状根在无激素的 MS筛选培养基上能够自主生长 ,在附加 BA2 .0 m g/L,NAA0 .2 mg/L 的筛选分化培养基上分化出不定芽 。

烟草fps转基因发状根的离体培养及其抗菌性

为研究fps基因在烟草发状根中的表达对发状根生长及物质代谢的影响,对fps转基因发状根株系k-3离体培养条件下的生长特性及抗菌性进行了研究.在摇瓶悬浮培养过程中,发状根生长呈现"S"型曲线,最初生长缓慢,到第10天开始迅速生长,25 d进入生长平台期;利用气升式内环流生物器,在25℃通气量为2 L/min,接种量为1 g的条件下培养25 d,发状根鲜重达94.7 g/L;以赤星病菌(Alternaria alternata)粗毒素为诱导子对发状根诱导培养,转基因发状根浸提液在黑胫病根刺接种试验中,能够明显提高烟草幼苗对黑胫病的抗性.

有机物质对烟草发状根生长及辅酶Q_(10)合成的影响

采用液体悬浮培养的方法,以中烟99品种烟草发状根为材料,研究了有机物质盐酸硫胺素、肌醇、酵母膏、L-半胱氨酸、甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-α-丙氨酸等对烟草发状根生长和辅酶Q10生物合成的影响。结果表明,适当浓度的盐酸硫胺素、L-半胱氨酸、甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-α-丙氨酸可明显促进发状根的生长及辅酶Q10的合成;酵母膏不利于发状根的生长和辅酶Q10的合成;肌醇可促进发状根的生长,但对辅酶Q10的合成没有促进作用。

人参发状根与栽培人参有效成分的比较研究

为了研究人参发状根这种有别于人参的特殊器官与人参之间的关联,采用考马斯亮蓝法测定了人参各部位的蛋白含量,同时采用标准曲线法测定了人参发状根与其它不同部位的皂苷含量、游离氨基酸含量、可溶性糖含量、过氧化物酶含量和丙二醛含量等各项生理生化指标,并与栽培人参根的各部位进行比较。结果表明:人参发状根中的皂苷含量高于栽培人参中的皂苷含量,且以人参芦头和人参须根的皂苷含量最高;固体培养的人参发状根和液体培养的人参发状根的皂苷含量相比,尤以液体培养的人参发状根的皂苷含量最高,可达3.05%,发状根的丙二醛MDA与栽种人参芦头和人参须根中的MDA均偏低。

Ri质粒转化牛膝及其发状根的培养

用发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）的Ｒｉ质粒转化药用植物牛膝（ＡｃｈｙｒａｎｔｈｅｓｂｉｄｅｎｔａｔａＢＬ．），诱导出了抗卡那霉素的发状根。将诱导的发状根进行固体平板培养和液体悬浮培养。在附加Ｋｍ３０ｍｇ／Ｌ的ＭＳｏ和１２ＭＳｏ培养基上，发状根生长良好，而未经转化的对照组则死亡，表现出生长激素自主性。在附加外源激素ＩＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ和ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ时，能促进发状根的成活、侧根的形成以及提高增殖倍数。表明适量的外源激素能促进发状根的生长。

丹参发状根再生植株的研究

丹参发状根再生植株的研究上海中医药大学黄炼栋，胡之璧，刘涤（２０００３２）关键词丹参，发状根，再生植株植物再生植株的发生一般需要外源激素的调控［１，２］。而我们发现，丹参发状根在无外源激素条件下可自发形成再生植株，这对研究植物的分化具有重要的意义。材...

Ri质粒及发状根研究进展

阐述了Ri质粒分子生物学及Ri质粒转化植物细胞的一般机制;对Ri质粒及发状根的应用进行了综述和展望.

芸芥发状根的诱导及其植株再生体系的建立

通过发根农杆菌R1000介导的遗传转化建立了芸芥发状根的诱导、培养及植株再生体系.研究了影响发状根诱导及生长的各种因素,通过PCR对所得发状根进行了分子水平的鉴定.结果表明:发根农杆菌R1000的rol B基因已被成功地转入并整合到该发根培养物的基因组中.

罗布麻组织培养及发状根的诱导

目的:罗布麻愈伤组织的培养及发状根的诱导。方法:以罗布麻无菌种子来源的愈伤组织为材料,选出适合于诱导发状根的较硬而分生细胞较多的愈伤组织扩增的培养基,对扩增的愈伤组织进行液体培养,摸索适合诱导发状根的培养条件。结果:适合于诱导发状根的较硬而分生细胞较多的愈伤组织扩增培养基为:MS+0.5mg/L 6-BA+0.3 mg/LNAA+300mg/L LH,在24±2℃,光强度为1500-2000Lx,光照周期为12h光/12h暗下培养;在17-200C、60rpm的黑暗、换液周期为40-42d的条件下培养,适合于发状根产生的培养基为1/2MS+0.1mg/LNAA+35g/L蔗糖,低温是罗布麻发状根产生和生长的必要条件。本文的研究结果为罗布麻发状根的规模化培养体系的建立和主要次生代谢药物的代谢调控研究奠定了基础。

光对商陆发状根生长和PAP基因表达的影响

利用发根农杆菌菌株Ar1334与美洲商陆（Phytolacca americana）叶片外植体共培养转化体系,共获得58个发状根无性系（SL-1-58）.以发根农杆菌Ri质粒TL-DNA上的rol C基因设计特异引物,对发状根进行PCR检测,得到了预期的560 bp目的片段,表明Ri质粒T-DNA整合到发状根基因组中.将筛选出的株系SL-7接种在MS培养基上分别置于光、暗条件下进行培养.结果发现：SL-7在暗培养条件下呈乳白色,具有多分枝、多根毛、无向地性等典型的发状根特性;在光培养条件下,发根呈粉红色,少分支且生长缓慢;以商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein,PAP）cDNA片段为探针,分别对光、暗条件下的发状根进行Northern blot检测,发现光对PAP基因的转录具有一定抑制作用;将发状根粗蛋白提取液与TMV病毒液混合后,摩擦接种于心叶烟（Nicotiana glutinosa）离体叶片,发现暗培养的发状根粗蛋白提取液对TMV抗性明显提高.表明商陆发状根的生长及PAP基因的表达都受到光的负向调控.该结果为商陆发状根的规模化培养和PAP蛋白的离体合成优化体系的建立奠定了基础.

除虫菊愈伤组织和发状根中除虫菊酯杀虫活性测定

以除虫菊作为材料探讨除虫菊愈伤组织和发状根中除虫菊酯的杀虫活性,为利用细胞工程生产除虫菊酯提供理论依据。以除虫菊的茎和叶作为外植体诱导愈伤组织和发状根,用丙酮浸提愈伤组织和发状根中的除虫菊酯,然后以粘虫作为测试对象采用浸虫和浸叶2种方式测定除虫菊酯的杀虫活性。结果表明:除虫菊愈伤组织和发状根中的除虫菊酯有杀虫活性,其对粘虫的拒食作用强于触杀作用,且发状根中除虫菊酯的杀虫活性优于愈伤组织,以浸虫方式处理的除虫菊酯杀虫活性更高。本文为未来利用细胞工程方式工业化生产除虫菊酯开拓了新途径。

黄花败酱发状根培养体系的建立及其抑菌作用研究

目的:初步建立黄花败酱发状根培养体系,并考察其抑菌效果。方法:采用发根农杆菌1601、15834、A4、1000等4种G-土壤杆菌诱导黄花败酱外植体产生发状根,考察不同外植体、菌株、侵染时间、预培养和共培养时间对黄花败酱毛状根诱导率的影响,并对发状根进行PCR检测;同时采用纸片扩散法测定其抑菌效果。结果:黄花败酱茎段作为外植体,预培养和共培养48 h,发根农杆菌A4侵染8 min,MS液体培养基p H为6时添加蔗糖浓度为40 g/L时转化率和增殖量最高,提取毛状根中总黄酮的含量为9.12%。应用PCR证实A4质粒上的rol B基因片段成功转入被感染的黄花败酱发状根中。结论:建立了黄花败酱毛状根培养体系,其发状根提取液对金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用。

潮霉素作为筛选剂对大豆发状根诱导的影响

筛选标记是转基因材料创制中转化细胞存活、生长和发育筛选的基本要素。选用4个不同的大豆基因型,分别以发根农杆菌诱导子叶节产生发状根的数量和根的伸长量为指标,研究了不同质量浓度潮霉素对发状根诱导和根伸长的影响,以期为大豆遗传转化过程中筛选剂的多样性选择及抗潮霉素育种奠定基础。结果表明:潮霉素可以有效抑制非转化细胞的生长,能够用作大豆发状根转化系统中的筛选剂,但不同基因型大豆品种对潮霉素的敏感性存在较大差异。自贡冬豆、吉林小粒1号、吉育47和中黄30在发状根诱导阶段的潮霉素适宜筛选浓度分别为40,16,16,24 mg·L-1;根伸长阶段分别为49,46,33,55 mg·L-1。

悬浮培养中不同理化因子对烟草发状根生长及烟碱合成的影响

悬浮培养中烟草(Nicotianatabacum)发状根的生长及烟碱合成受到基本培养基浓度、初始pH值、激素种类和浓度等因素的影响。一个5cm长的根尖,悬浮在40mL、pH值为6.0、附加1.0mg.L-1IAA的1/2MS液体培养基中,28℃、散光条件下培养30天,烟碱产量可达0.241mg.mL-1。