基于绿豆发状根的快速CRISPR/Cas9基因编辑方法

由于缺乏有效稳定的遗传转化体系,导致基因编辑技术在绿豆中的应用受到极大限制,也使绿豆基因功能研究受到极大阻碍。因此,建立一套基于发根农杆菌的操作简便、快速且高效的绿豆嵌合植株转化技术,可以为绿豆基因功能研究提供技术支撑。首先在CRISPR/Cas9载体骨架中插入1个绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达框用于阳性发状根的快速筛选,然后将含有靶标基因gRNA的CRISPR/Cas9质粒导入发根农杆菌K599。菌液注射侵染绿豆幼苗植株下胚轴,评价K599在绿豆中诱导发状根发生及CRISPR/Cas9系统在绿豆转基因发状根组织中的效率。结果显示,K599菌液侵染种植7 d的绿豆幼苗植株并在保湿条件下培养3周可在侵染点诱导发状根产生,此嵌合植株在切除原生根后可在霍格兰培养液中正常生长且培养1周后即可用于后续检测。用GFP筛选的结果显示,阳性发状根占比约为(57.8±10.0)%。随机选择15个荧光检测阳性的转基因发状根组织,利用测序检测靶位点的编辑效果,结果显示有10个靶位点的序列发生了突变,突变比例达到67%,其中碱基缺失突变9个,碱基转换突变1个。由本研究结果可知,利用该方法可以在无菌组织培养的条件下于4周内获得目的基因编辑的转基因组织,极大地便利了绿豆分子水平上的功能研究,也为其他尚缺乏稳定遗传转化体系的作物进行基因功能研究提供了参考。

潮霉素作为筛选剂对大豆发状根诱导的影响

筛选标记是转基因材料创制中转化细胞存活、生长和发育筛选的基本要素。选用4个不同的大豆基因型,分别以发根农杆菌诱导子叶节产生发状根的数量和根的伸长量为指标,研究了不同质量浓度潮霉素对发状根诱导和根伸长的影响,以期为大豆遗传转化过程中筛选剂的多样性选择及抗潮霉素育种奠定基础。结果表明:潮霉素可以有效抑制非转化细胞的生长,能够用作大豆发状根转化系统中的筛选剂,但不同基因型大豆品种对潮霉素的敏感性存在较大差异。自贡冬豆、吉林小粒1号、吉育47和中黄30在发状根诱导阶段的潮霉素适宜筛选浓度分别为40,16,16,24 mg·L-1;根伸长阶段分别为49,46,33,55 mg·L-1。