真空干燥重组运动发酵单胞菌发酵剂的研制

利用重组运动发酵单胞菌制备乙醇发酵剂,研究保护剂、菌泥与保护剂比例、复合保护剂以及真空干燥条件等因素对菌体存活率的影响。实验结果表明,单一乳糖对重组运动发酵单胞菌的保护效果最佳,菌泥与乳糖的最佳配比为1∶1,菌体存活率为83.24%。分别以乳糖质量的10%、15%、20%添加全蛋粉、蔗糖、海藻糖以及山梨醇组成复合保护剂,得到乳糖与蔗糖复合保护剂的菌体存活率达到最高为92%。通过对干燥过程中复合保护剂与菌泥比例、温度、真空度优化后得到菌体的存活率进一步提高至95.96%。实验结果表明,复合保护剂对重组运动发酵单胞菌在真空干燥条件下具有很好的保护作用。

运动发酵单胞菌鼓风干燥工艺

试验旨在研究运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)鼓风干燥保护剂的添加。本试验以细菌总数和活菌数为指标,采用固态培养基培养运动发酵单胞菌,然后用鼓风干燥的方式对运动发酵单胞菌进行干燥处理,最后使用25%葡萄糖培养基进行发酵,以失重方式评估其活性。结果显示,培养的细菌数达到1.85×10^(10)CFU/g。用固态培养基等质量的乳糖+5%的甘露糖、+2%或+4%的甘油作为组合保护剂,在39℃鼓风干燥过程中细菌数达到1.31×10^(10)CFU/g和1.2×10^(10)CFU/g,且存活率超过94%。干燥前后的失重结果基本一致,表明鼓风干燥后的细菌具有较高活性。

运动发酵单胞菌同步糖化发酵厨余垃圾制取乙醇

以学生食堂的厨余垃圾为原料,接种运动发酵单胞菌同步糖化发酵制取燃料乙醇,探讨其发酵过程的影响因素,并与酵母发酵的结果进行对比.结果表明,较适宜的乙醇发酵条件为:固液比1:0.5,pH5,接种量10%,温度30℃,发酵时间40h,在此条件下,乙醇产量为53g/L.与接种酵母进行乙醇发酵相比,运动发酵单胞菌发酵具有乙醇产率高,发酵速率快等优点,可以有效地从厨余垃圾中生产乙醇.

固定化运动发酵单胞菌乙醇发酵研究

以运动发酵单胞菌(zymomonas mob ilis 10225)为菌种,以葡萄糖为底物进行乙醇发酵。对不同底物浓度[5%,7.5%,10%(W/V)]、不同温度(25℃,30℃,35℃)条件下,游离细胞和固定化细胞乙醇发酵的特性进行研究。实验结果表明,葡萄糖浓度为5%,25℃时可达到最大的乙醇产率0.50g乙醇/g葡萄糖。以海藻酸钙为包埋介质,对Zymomonas mob ilis进行固定化,在10%葡萄糖培养基中多批次半连续发酵,可在8h内使乙醇产率系数达到0.50。短的发酵周期和高的乙醇产率为后续的葡萄糖和木糖两步乙醇发酵提供理想的实验数据。

副产物对运动发酵单胞菌酒精发酵的影响

研究了乙酸、乳酸、糠醛作为酒精发酵副产物 ,对细菌酒精发酵的影响。在发酵培养基中 ,当乙酸浓度为 1 5 g/L ,糠醛浓度为 4g/L时 ,细菌酒精产量开始减少。在乳酸浓度为 0～ 2 g/L的范围内 ,没有观察到其对细菌酒精发酵的抑制作用。运用化学渗透假说 ,对酸在细菌酒精发酵中的抑制作用进行了解释 。

产乙醇运动发酵单胞菌的研究进展

运动发酵单胞菌作为天然生产乙醇的主要微生物之一,具有特殊的Entner Doudoroff途径和其他一些特殊的糖代谢和能量代谢方式,因此具有乙醇产率高和乙醇耐受力强的显著特点。通过简述运动发酵单胞菌的糖代谢和能量代谢、乙醇和高渗透压等耐性及其遗传改造三方面的研究进展。

鲜甘薯原料的运动发酵单胞菌快速乙醇发酵条件

对运动发酵单胞菌232B同步糖化发酵(SSF)鲜甘薯快速生产燃料乙醇的条件进行了研究.通过单因素试验和正交试验获得了乙醇发酵的最佳参数为:初始pH值6.0～7.0,硫酸铵5.0g/kg,糖化酶量1.6AUG/kg淀粉,初始总糖浓度200g/kg,接种量φ=12.5%.经过21h发酵,乙醇浓度为95.15g/kg,发酵效率可达94%.同时对不灭菌发酵也进行了研究,发酵效率可达92%.残糖的HPLC分析结果说明,发酵液中已没有葡萄糖存在,经酸水解后又出现了葡萄糖、半乳糖、甘露糖等成分,说明发酵结束后的残糖是多种低聚糖.

运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以总DNA为模板,采用PCR技术克隆得到运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase)基因pdc,将该基因连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSE-pdc.将此重组质粒转化到受体菌E.coliDH5α中,挑取重组菌株.经IPTG诱导后,在乙醛指示平板检测到丙酮酸脱羧酶活性.SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带:其分子量约为60KD.

重组运动发酵单胞菌的构建及木糖利用特性研究

将大肠杆菌(Escherichia coli)木糖代谢的关键酶基因。引入到运动发酵单胞菌中,获得能利用木糖发酵生产乙醇的重组工程菌株PZM。混合糖发酵过程中,重组菌利用葡萄糖和木糖生成乙醇的效率分别达到理论值的81.2%和63.1%。

乙醇发酵重组大肠杆菌的构建——运动发酵单胞菌pdc基因在大肠杆菌中的高效表达

为了使大肠杆菌代谢葡萄糖和木糖产乙醇,将运动发酵单胞菌乙醇发酵途径中的关键酶基因丙酮酸脱羧酶基因与质粒载体pGM-T连接转化至大肠杆菌TOP10中。丙酮酸脱羧酶基因在T7启动子的启动下得到了高效表达。构建的重组大肠杆菌不但能利用葡萄糖也能利用木糖产乙醇,在葡萄糖和木糖同时存在时,优先利用葡萄糖。

运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒的构建

运动发酵单胞菌(Zymomonas．mobilis)是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种；但由于其可利用的碳源范围窄,所以对其进行基因工程改造首先需要有较好的载体系统．以Z．mobilis内源质粒pZM2和大肠杆菌(E．coli)质粒pBR328、pACYC184为出发质粒,构建了三个Z．mobilis-E．coli之间的克隆型穿梭质粒,即pZB1、pZB21和pZB31．对它们在Z．mobilis CP4中的稳定性、拷贝数的初步比较分析表明：pZB21最稳定、拷贝数最高,pZB31次之,pZB1最差．进一步以pZB21为载体,在Z．mo- bilis CP4中表达E．coli的talB基因,酶活水平为0．087 U/mg蛋白．证明pZB21是能用于基因表达的、较为理想的Z．moblis-E．coli之间的穿梭载体．

运动发酵单胞菌和休哈塔假丝酵母混合发酵秸秆产乙醇

首先考察了运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis,Z.mobilis)和休哈塔假丝酵母(Candida shehatae,C.shehatae)分别利用葡萄糖或木糖为唯一底物时的乙醇发酵特性;其次,研究了单菌及双菌发酵混合糖(葡萄糖和木糖比例为3∶1)的产乙醇性能;在此基础上,考察了单菌和双菌培养应用于玉米秸秆发酵产乙醇的可行性。结果表明,Z.mobilis和C.shehatae的接种方式显著影响混合糖发酵产乙醇的效率,当分步接种发酵48 h后,乙醇产量达到最高,为25.77 g/L。当以60 g/L Na OH预处理的玉米秸秆为底物时,分步接种可高效利用秸秆酶解产物(葡萄糖和木糖)实现乙醇产量的最大值(22.34 g/L),提示Z.mobilis和C.shehatae分步接种发酵可最大化地发酵秸秆中的葡萄糖和木糖生产乙醇,有利于乙醇的高产率生产,可为实现纤维原料生产燃料乙醇的工业化提供参考。

运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术 ,以基因组DNA为模板克隆得到运动发酵单胞菌 (Zymomonasmobilis)乙醇脱氢酶 (alcoholdehydrogenaseⅡ )基因adhB ,连接到表达载体 pSE380上 ,得到重组质粒 pSE adhB。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α中 ,重组菌株经IPTG诱导后 ,在乙醛指示平板检测到乙醇脱氢酶活性。SDS PAGE电泳结果显示出明显的 4 0KD特异性蛋白质条带。重组菌株经诱导培养 ,每毫升发酵液酶活力为 5u。

一株运动发酵单胞菌Zy-1快速生产乙醇

经多次实验优化，得到运动发酵单胞菌Zy发酵葡萄糖生产乙醇较合适的条件．Zy的诱变菌株Zy-1在该条件下发酵葡萄糖生产乙醇比原始菌株更有较大优势．当葡萄糖浓度为200gL^-1时，发酵48h，乙醇浓度96．5gL^-1，残糖2．3gL^-1，发酵效率为94．42％．Zy-1发酵天然原料米粉、木薯、红薯干等，发酵时间44h，乙醇浓度达95gL^-1以上，发酵效率92％以上．发酵液用DNS法测定，还原糖约2gL^-1，残总糖因原料种类不同，其值有所差异（5～20gL^-1）．经薄层层析分析，发酵液无葡萄糖，而是二糖、三糖等低聚糖．

用正交试验法选择运动发酵单胞菌的最佳发酵培养基

用正交试验法对运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis的发酵培养基进行了研究,选择酒精产率高、残糖少的发酵培养基。用L_(27)(3^(13))表安排四因素三水平,并考虑交互作用的实验,对葡萄浓度,酵母膏浓度、培养温度及pH值进行了考查,对实验结果进行了方差分析,确定了合适的发酵培养基。

pH值对运动发酵单胞菌葡萄糖代谢酶活性影响的研究

以运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ATCC31821模式菌株，研究pH值条件对其葡萄糖代谢关键酶活力的影响。结果表明：发酵液pH5．5时，胞内乙醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖激酶、葡萄糖－6-磷酸脱氢酶的活力较高，而异柠檬酸脱氢酶活性较低，能促进乙醇的生成：pH5．0时，苹果酸脱氢酶的酶活力较低，使糖酵解反应向另一个方向发生偏移，促进乙醇的形成。pH4．0-6．5时，丙酮酸激酶和甘油醛．3－磷酸脱氢酶的酶活力水平相差不大，说明pH值对这2种酶的活性影响甚微。因此，pH5．0～5．5，代谢途径（如糖酵解途径、ED途径等）中的胞内代谢酶活性增强，有利于乙醇的产生。

重组运动发酵单胞菌发酵木糖产乙醇的研究

用大肠杆菌的木糖代谢基因xylA、xylBt、ktAt、alB构建转座载体pXT,用于转座运动发酵单胞菌而使其获得新的代谢途径,能发酵木糖产乙醇。经转座获得的重组菌ZM-mtc9xt能在以木糖为唯一碳源的培养基上生长;在23%(质量体积比,下同)葡萄糖、6%(质量体积比,下同)木糖发酵中最高乙醇产量分别为98.3 g·L-1、24.1 g·L-1;在17%葡萄糖+6%木糖混合糖发酵中乙醇产量为88.9 g·L-1,比原始菌提高了22%。与原始菌相比,重组菌产生乙醇的速度显著加快,能在更低的营养条件和更高的温度下发酵生产乙醇。

雅致放射毛霉和运动发酵单胞菌混合发酵霉豆渣研究

研究雅致放射毛霉和运动发酵单胞菌混合发酵霉豆渣的条件,并在最优发酵条件下测定产品的pH值、氨基态氮含量、总粗蛋白含量及质构在发酵过程中的变化。通过正交试验确定霉豆渣发酵的最优条件为:豆渣蒸煮15min后,在100g豆渣中接入105CFU/mL雅致放射毛霉孢子悬液1.0mL及107CFU/mL运动发酵单胞菌悬液0.2mL,28℃培养3d。在发酵过程中,霉豆渣的pH值从5.12上升至8.40后缓慢下降至8.09;氨基态氮含量则先迅速上升后缓慢下降;总粗蛋白含量逐渐下降。发酵过程使霉豆渣的硬度和咀嚼性明显提高。

运动发酵单胞菌ZM4、CP4菌株基因工程选择标记的研究

尽管质粒和选择标记的使用作为基因工程最基本的一环而为人们所熟知,但对一些特殊菌种(菌株)或研究很少的菌种(菌株)的基因工程操作来说,质粒和选择标记可能仍然是一个并未完全解决的问题,因而需要不断提高认识、不断改进。运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis具有突出的产醇性能,但其多种内源质粒和多种抗性的特点,增加了其基因工程操作时质粒和选择标记选用的难度。本研究在测定四个抗生素即Ap、Cm、Tc、Km对典型菌株ZM4、CP4的最低生长抑制浓度的基础上,初步确定了这两个菌株基因工程操作时的四个抗生素使用浓度依次分别为300、100、25、350μg/mL(ZM4)和500、100、25、250μg/mL(CP4);并进一步通过穿梭载体pZB21、宽宿主载体pBBR1MCS-2和整合载体pBR328-ldhR-cml-ldhL的转化,初步分析和证明了这些选择标记和在相应抗生素浓度下的效果:首先,对每一个选择标记基因来说,前述抗生素浓度是适于携带此选择标记基因的质粒的转化筛选和相应转化子培养的;其次,在前述抗生素浓度下,综合筛选平板阳性率和转化效率、培养物菌体形态异常程度等指标,四个选择标记基因中,以Cm和Tc抗性标记基因效果最好,Km抗性标记基因居中,Ap抗性标记基因最差。这些结果为ZM4、CP4基因工程遗传改造用抗性标记基因、质粒、抗生素的选择及转化系统的完善奠定了基础。

运动发酵单胞菌乙醇发酵条件的优化

通过对运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)乙醇发酵条件和培养基成分分别进行单因子优化和正交优化,确定运动发酵单胞菌Z1乙醇发酵最佳葡萄糖含量为10%~15%,最适接种量为发酵培养基体积的1%,最佳发酵温度为30~35℃,培养基最适pH为6.0~9.0;其发酵培养基最佳基础成分为:MgSO40.01%,(NH4)2SO40.18%,KH2PO40.18%,酵母膏0.9%;在这4种成分中酵母膏对乙醇产率的影响最大。