关节软骨细胞外基质源性软骨组织工程取向支架的制备

背景:仿生天然软骨细胞外基质特殊的力学、结构特性和生化成分的软骨组织工程支架具有巨大的应用潜能。目的:观察仿生天然关节软骨细胞外基质的生化和结构特性,探讨关节软骨细胞外基质材料及软骨组织工程取向支架的制备方法,并对其理化性质进行检测。设计、时间及地点:组织工程材料支架制备及性能分析的体外实验,于2007-07/2008-07在解放军总医院骨科研究所完成。材料:将新鲜猪关节软骨湿法粉碎,差速离心,收集无细胞的软骨细胞外基质成分。脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶及碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺均为美国Sigma公司产品。方法:对关节软骨细胞外基质材料进行组织学和形态学检测后,用pH3.2的稀盐酸制成质量浓度为20g/L溶液,采用定向结晶及冷冻干燥技术制成关节软骨细胞外基质源性取向支架,再采用物理化学方法交联,同时制备多孔软骨细胞外基质源性非取向支架。主要观察指标:①关节软骨细胞外基质材料的生化组成和形态。②软骨细胞外基质取向支架和非取向支架的表面特征及孔道结构。③取向和非取向软骨细胞外基质支架的孔隙率、吸水膨胀率、力学特性的比较。结果:收集的关节软骨细胞外基质材料中无细胞存在,纤维为纳米尺度,甲苯胺蓝、番红花O、奥新蓝染色及Ⅱ型胶原染色阳性;制备的取向支架具有纵向排列的孔道结构,孔径100～200μm,分布均匀,非取向支架的孔呈海绵样结构;两种支架孔隙率均≥95%,吸水膨胀率均≥96%。取向支架纵向压缩模量和拉伸模量为:(2.02±0.02),(22.10±0.67)MPa,均大于非取向支架,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:天然关节软骨细胞外基质材料与天然关节软骨的生物力学特性相似,可满足软骨组织工程的需要,是一种比较理想的软骨组织工程支架。

基于软骨细胞外基质的取向支架的制备及评价

目的制备软骨细胞外基质(CECM)取向多孔支架,评价其理化特性及对脂肪干细胞(ADSCs)的相容性。方法切取新鲜猪关节软骨片,匀浆后离心筛选出直径50~500 nm左右的软骨纤维,经Triton X-100脱细胞后制备成浓度6%的CECM浆料,通过定向结晶和冷冻干燥后交联即得CECM取向支架。对CECM取向支架的理化性能和细胞相容性进行评价。结果 CECM取向支架横断面为均匀的多孔网状结构,孔壁上密布软骨纤维,纵断面为垂直管状结构;支架呈苏木精-伊红红染,甲苯胺蓝、番红O、天狼星红染色均呈阳性;支架孔隙率、吸水率和纵向压缩弹性模量分别为95.455%±0.910%、95.889%±1.071%和(40.208±5.097)k Pa;ADSCs在支架上黏附和增殖,并均匀长入支架孔隙内。结论 CECM取向支架的成分与天然软骨相似,生物相容性良好,孔隙结构、孔径大小适于种子细胞黏附、增殖和长入,是一种比较理想的软骨组织工程支架。

丝素蛋白-软骨脱细胞外基质复合取向支架的制备及评价

目的制备丝素蛋白(SF)-软骨脱细胞外基质(CECM)仿生支架材料,检测其理化性能特性。方法采用改良温度梯度热诱导相分离(TIPS)技术结合冷冻干燥法制备出CECM取向支架,然后将CECM浆料与制备好的SF溶液按照质量比1∶1混合后配制成质量分数6%的浆料,通过TIPS技术制备出SF-CECM复合取向支架。对SFCECM复合取向支架进行扫描电子显微镜(SEM)观察和组织学染色,同时测定支架孔隙率、吸水性以及力学性能。结果 SEM观察可见,支架横断面呈多孔网状结构,纵剖面呈垂直的管状结构。组织学染色显示复合支架脱细胞彻底,有蛋白多糖、胶原成分,与天然软骨成分相似。支架孔隙率、吸水率和纵向压缩弹性模量分别为95.733%±1.010%、94.309%±1.302%和(65.40±4.09)k Pa。结论 SF-CECM复合取向支架具有良好的理化特性和生物力学性能,有望成为较理想的组织工程软骨支架。

ACECM取向支架--软骨组织工程的新时代

关节软骨是无血管结构并且受伤的软骨不能自我修复,从而导致关节疼痛和关节失稳,并最终导致关节置换。因此,研究者把软骨组织的再生和修复工程作为一种很有前途的方法。在本文中,我们回顾了的正常结构和功能的关节软骨,软骨损伤的修复方法,软骨组织工程的临床技术的历史。最后,我们得出的结论是ACECM取向支架移植技术可能会取代基质诱导的自体软骨细胞移植(MACI),越来越多的患者会从这项技术中受益。

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。

软骨细胞复合人脐带Wharton胶取向支架的体外评估

目的将软骨细胞复合于人脐带Wharton胶取向支架,体外评估该支架对软骨细胞的影响和作用。方法取成年新西兰大白兔肩关节软骨组织分离培养软骨细胞。取正常新生儿脐带组织,通过湿润粉碎结合化学脱细胞技术脱细胞,利用冷冻干燥及交联等技术制备人脐带Wharton胶取向支架。取第2代软骨细胞与人脐带Wharton胶取向支架复合培养,倒置显微镜、扫描电镜观察细胞在支架上分布及黏附情况;甲苯胺蓝、番红O染色观察细胞细胞外基质分泌情况;二乙酰荧光素-碘化丙啶双色荧光检测法染色及Hoechst33258染色评估细胞在支架上的活力及增殖情况;将体外PKH26荧光标记的软骨细胞与支架复合培养,荧光显微镜观察。结果倒置显微镜观察示,培养3 d细胞在支架孔隙内分布较均匀,呈圆形或椭圆形;扫描电镜观察示,培养7 d大量细胞黏附于支架孔隙间,呈圆形或椭圆形,且细胞沿取向孔道伸展排列,相互聚集,增殖旺盛;组织学观察示,培养7 d,细胞在支架中分布均匀且增殖旺盛,细胞分泌大量细胞外基质,取向支架能引导细胞迁徙和增殖,并能有效保留和促进细胞外基质分泌;细胞活力评估结果示,培养3 d见支架上黏附的大部分细胞为活细胞,细胞成活率高达90%以上。荧光显微镜观察示,荧光标记细胞与支架复合培养1 d,细胞在支架内部均匀分布,增殖旺盛。结论人脐带Wharton胶取向支架具有良好的亲和性和细胞相容性,有利于软骨细胞黏附和增殖,细胞存活率高,是一种比较理想的软骨组织工程支架材料。

蚕丝蛋白/PCL共混取向纤维的力学性质与细胞响应

蚕丝蛋白因其良好的机械强度、生物相容性和耐灭菌性,是目前骨修复领域不可多得的天然蛋白支架材料。为提高蚕丝蛋白支架对细胞定向移动的引导能力和力学强度,采用静电纺丝方式制备较高取向度的PCL/蚕丝蛋白共混纤维支架,并与非取向型对比。通过扫描电镜图像分析技术表征静电纺丝纤维表面的取向度,并比较不同纤维排列结构下的力学性质。间充质干细胞在骨修复中应用广泛。人源骨髓间充质干细胞来自健康献髓者,在体外培养条件下,测试不同结构材料对间充质干细胞增殖的影响,并使用活细胞工作站实时追踪细胞在不同材料表面的运动功能。结果表明,在取向静电纺丝纤维支架中,91%的纤维分布于"10°范围以内,且该支架具有力学的各向异性,具有较大的轴向拉伸模量。在间充质干细胞增殖96 min后,中取向静电纺丝纤维支架组的细胞数量产生显著差异。在取向纤维材料表面生长的间充质干细胞展现出最小的细胞分布夹角,仅为6.57°±4.45°,同时,取向纤维表面的细胞长度有显著提高(236.46±82.00)μm。在进一步的实时细胞追踪中,在细胞的主要移动方向上,取向纤维表面的细胞分解移动速度达6.66μm/h,远远高于其他表面。因而,取向静电纺丝纤维支架可能在体内应用中支持成体干细胞增殖,并加快早期细胞定向迁移。