猪T细胞受体α链基因的克隆、序列分析及其结构预测

旨在为研究猪T细胞受体分子结构与功能,并首次在国内克隆了猪T细胞受体α链基因。以GenBank上登载的猪T细胞受体（Tcell receptor,TCR）α链（AB087988）为参考序列,从甘肃合作猪外周血液淋巴细胞中用RT-PCR的方法克隆了TCR-α链基因（pTCR-α）。结果表明：克隆的TCR-α基因具有完整的ORF,全长819 bp,编码272个氨基酸,预测蛋白分子量为30 kDa,含18个强碱性氨基酸,23个强酸性氨基酸,87个疏水性氨基酸和103个极性氨基酸,含有一段20个氨基酸的信号肽序列;与GenBank上登载的TCR-α参考序列（AB087988）的同源性为94.6%,与其他具有完整ORF的猪TCR-α相比,同源性为54.4%-80.3%。推测可能是一新的TCR-α基因转录本。同时,应用生物信息学技术分析了其基因序列及编码蛋白的结构特征,这为猪T细胞受体分子结构与功能的研究奠定了基础。

牛Ⅰ型干扰素受体α链与其配体结合活性的鉴定

为研究牛Ⅰ型干扰素受体α链(IFNAR1)与其配体结合的生物学性质,本研究采用RT-PCR方法从感染水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的犊牛原代肾细胞中扩增得到IFNAR1基因,然后构建了表达BoIFNAR1胞外区多肽(BoIFNAR1-EC)的原核表达载体pET30a-BoIFNAR1-EC,在RosettaTM(DE3)pLysS宿主菌中表达出重组蛋白rBoIFNAR1-EC,并以纯化后的rBoIFNAR1-EC作为免疫原制备兔抗牛IFNAR1的多克隆抗体,随后鉴定BoIFNAR1与其配体的结合活性。结果表明,试验成功克隆得到1 685bp的牛IFNAR1基因,编码560个氨基酸,由24个氨基酸组成的信号肽、414个氨基酸组成的胞外区、23个氨基酸组成的跨膜区及99个氨基酸组成的胞内区组成,与其他物种IFNAR1氨基酸序列同源性为63%~91%,在进化上具有高度保守性,其与羊的亲缘关系最近。随后构建了含牛IFNAR1胞外区基因的重组表达载体,并诱导表达了重组牛IFNAR1胞外区蛋白rBoIFNAR1-EC,其在大肠杆菌中几乎全部为可溶性表达,经纯化透析后作为免疫原制备了兔抗牛IFNAR1的特异性抗体,抗体效价高达1∶204 800。配体结合试验表明,牛IFNAR1重组蛋白可与牛IFN-αA和IFN-ε结合,其多克隆抗体可阻断牛IFN-αA和IFN-ε与细胞表面的IFNAR1特异性结合,进而阻断牛IFN-αA和IFN-ε的抗病毒信号传导。

人高亲和力IgE受体α链基因克隆及表达

目的:克隆人高亲和力IgE受体α链基因,并进行原核表达,制备出可溶性FcεRIα蛋白。方法:应用RT-PCR技术,从皮肤组织的总RNA中扩增人高亲和力IgE受体α链基因,连接至PUCm-T载体,重组克隆进行DNA测序。将测序证实的目的片段与高效表达载体pET30a连接,构建重组质粒并转入表达宿主菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化。结果:RT-PCR扩增出一个约950bp的DNA片段,测序结果显示该片段与GenBank上登录的FcεRIα基因序列完全一致;经原核表达后,获得相对分子质量37000的FcεRIα融合蛋白。结论:本实验成功克隆、表达了人FcεRIα基因,制备出可溶性FcεRIα蛋白,为抗FcεRIα抗体的检测及自身免疫性慢性荨麻疹发病机制的研究提供了条件。

可溶性白细胞介素2受体α链的检测与类风湿关节炎疾病活动性评估

目的:评价血清可溶性白细胞介素2受体α链(s IL-2Rα、sCD25)对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)活动度评估的临床意义。方法:收集RA患者血清108例,RA关节液标本40例,骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者血清39例,健康人血清50例,采用酶联免疫吸附(ELISA)检测各组血清、以及RA患者关节液中sCD25浓度,并记录RA患者的各项临床表现和实验室指标,分析其与血清sCD25浓度水平的相关性。结果:RA组血清sCD25(质量)浓度为(2 886±1 333) ng/L,OA组血清sCD25浓度为(2 090±718) ng/L,健康对照组血清sCD25浓度为(1 768±753) ng/L; RA患者的血清sCD25水平显著高于疾病对照组和健康对照组(P <0. 001);血清中sCD25水平与红细胞沉降率(r=0. 321,P=0. 001)、C-反应蛋白(r=0. 446,P <0. 001)、DAS28评分(r=0. 324,P <0. 001)、关节压痛计数(r=0. 203,P=0. 024)、D-二聚体(D-dimer)水平(r=0. 383,P <0. 001)、年龄(r=0. 24,P=0. 007)、总Ig G(r=0. 207,P=0. 028)、类风湿因子Ig G(r=0. 345,P=0. 034)呈正相关,与病程呈负相关(r=-0. 206,P=0. 021);在RA患者中,低疾病活动度组血清ESR、CRP和sCD25阳性率分别为14. 3%(2例),14. 3%(2例),71. 4%(10例);中疾病活动度组血清ESR、CRP和sCD25阳性率分别为94. 2%(49例)、82. 7%(43例)和86. 5%(45例);高疾病活动度组血清ESR、CRP和sCD25阳性率分别为100%(42例)、95. 2%(40例)和90. 5%(38例);有36例ESR和/或CRP为阴性(约33. 3%),在这36例中有17例(约47. 2%)血清s CD5水平升高,并且其中14例(约82. 4%) DAS28评分高于3. 2。结论:血清sCD25水平与RA活动性密切相关,表明sCD25可能参与了RA的炎症过程,并有望成为RA患者的一种新的炎症指标;血清sCD25的检测在RA处于病情活动期,但ESR和/或CRP为阴性时更有意义。

白细胞介素2受体α链(IL-2R_α):基因结构及表达调控

IL-2 R基因结构及表达调控是当代免疫学研究的重要课题,其阐明有助于揭示机体免疫应答及调节的机制。自1984年IL-2R_α链cDNA克隆建立以来,该领域研究已有很大突破,本文概要介绍了这方面的进展。

白介素4受体α链基因多态性与哮喘易感性的相关性研究

目的 探讨白介素 4受体α链 (IL 4Rα)基因多态性与武汉地区人群哮喘易感性的相关关系。方法 用逆转录 聚合酶链反应 /单链构象多态性 /测序技术对 35例哮喘儿童 ,2 5例成人发病哮喘患者 ,以及健康成人与健康儿童各 2 0名进行IL 4Rα链基因编码区 12 0 5 192 8基因突变检测分析。结果 5 7.8%的哮喘患儿在IL 4Rα基因编码区 190 2位存在突变 (A→G) ,使该编码区 5 76位谷氨酸突变为精氨酸 ,而仅有 8%的成人哮喘患者存在该突变 ,健康成人和健康儿童均有 5 %存在该突变。结论 本研究表明IL 4Rα链基因编码区 190 2位点单核苷酸的变异与武汉地区儿童哮喘易感性相关 (χ2 =12 .5 4 ,P <0 .0 0 1,α =0 .0 5 ) ;而成人哮喘患者则与该基因编码区 190 2位点单核苷酸的变异无关 (χ2 =0 .16 ,P >0 .0 5 ,α=0 .0 5 )。

白细胞介素-2受体α链和白细胞分化抗原40基因多态性与急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的关联研究

目的探讨免疫因子相关基因白细胞介素-2受体仅链（IL-2RA）rs2104286和白细胞分化抗原40（CD40）rs6074022多态性与急性一氧化碳中毒后迟发性脑病（DEACMP）之间的关联。方法选择豫北地区汉族DEACMP患者109例作为研究组，急性一氧化碳中毒（ACUte）未发生迟发脑病患者115例作为对照组，采用PCR．限制性片段长度多态性和荧光定量PCR技术，检测rs2104286和rs6074022的基因型，两组间的比较采用x^2检验。结果（1）DEACMP组rs2104286基因型（rr／T、T／C、C／C）和等位基因（T、C）分别为92例，17例，0例和201例，17例，ACMP组分别为93例，22例，0例和208例，22例，两组比较均差异无统计学意义（均P〉0．05）。DEACMP组rs6074022基因型（C／C、C／T、T／T）和等位基因（C、T）分别为17例，50例，42例和84例，134例，ACMP组分别为15例，52例，48例和82例，148例，两组比较均差异无统计学意义（均P〉0．05）。（2）按性别分层后，两组女性患者rs2104286及rs6074022基因型和等位基因比较均差异无统计学意义（均P〉0．05），两组男性患者rs2104286及rs6074022基因型和等位基因比较均差异无统计学意义（均P〉0．05）。（3）rs2104286及rs6074022基因不同基因型对DEACMP的发生无相互作用（均P〉0．05）。结论尚未发现rs2104286和rs6074022基因多态性与DEACMP关联的证据，暂不支持IL-2RA和CD40基因作为DEACMP的遗传易感基因。

血小板衍生生长因子-B链及受体-α链在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的探讨血小板衍生生长因子B链(PDGF-B)及受体α链(PDGFR-α)与非小细胞肺癌发生发展的关系。方法采用免疫组化LSAB法检测PDGF-B、PDGFR-α在85例非小细胞肺癌原发灶以及20例正常支气管黏膜中的表达。结果 PDGF-B在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞浆和/或细胞核中表达,PDGFR-α主要在NSCLC细胞浆中表达,个别在细胞核表达;与正常支气管粘膜组织相比,PDGF-B、PDGFR-α在NSCLC均过度表达(P<0.05);高分化腺癌组PDGFR-α阳性表达率明显高于低分化腺癌组(P<0.05);Ⅱ、Ⅲ期肺癌组PDGF-B阳性表达率明显高于Ⅰ期肺癌组(P<0.05)。结论 PDGF-B/PDGFR-α自分泌刺激环在NSCLC的发生中可能起重要作用;PDGFR-α阳性表达与肺腺癌分化呈正相关;PDGF-B的阳性表达与肺腺癌、鳞癌临床分期呈正相关。

耐力训练及补充中药多糖提取物对大鼠白细胞介素2及受体水平的影响

目的:探讨6周耐力训练及补充多糖提取物对大鼠白细胞介素2及受体水平的影响。方法:12 0只雄性Wistar大鼠随机分为6组:耐力训练+黄芪多糖组、耐力训练+牛膝多糖组、单纯耐力训练组、安静+黄芪多糖组、安静+牛膝多糖组和安静对照组。每组又均分为4周组(7只大鼠)和6周组(13只大鼠)。6周递增负荷游泳训练后,观察大鼠白细胞介素2及受体水平的改变。结果:(1) 6周耐力训练可造成大鼠血清IL - 2、T细胞mIL - 2Rα表达下降(P均小于0 . 0 5 )和sIL -2R升高(P <0 . 0 1)。(2 ) 6周耐力训练同时补充黄芪多糖和牛膝多糖提取物能防止大鼠血清IL -2、T细胞mIL - 2Rα表达明显下降及sIL - 2R升高。结论:黄芪多糖和牛膝多糖可通过调节IL - 2及其受体发挥对耐力训练大鼠细胞免疫的调节作用。

青霉素过敏反应与IL-4Rα基因多态性

目的：青霉素类抗生素临床应用十分广泛，但其过敏反应发生率居各类药物之首。青霉素过敏反应的发生，通常伴有血清总IgE或特异性IgE的升高。白细胞介素4（IL-4）是目前已知最强的IgE调节因子，其生物学效应是通过与靶细胞表面的白介素4受体（IL-4R）结合而发挥的。因此，本试验以白介素4受体α链（IL-4Rα）基因为研究对象，重点讨论该基因的部分多态性位点与青霉素过敏反应及血清特异性IgE的关系。方法：采用RAST检测了242例过敏病人和86例正常对照血清中4种药物青霉素G、青霉素V、氨苄西林和阿莫西林（PG、PV、AP、AX）的8种抗原决定簇（BPO—PLL、PVO。PLL、APO-PLL、AXO-PLL、BPA—PLL、PVA—PLL、APA-PLL、AXA-PLL）的特异性IgE抗体：采用PCR-RFLP检测了242例过敏病人和220例正常对照IL-4RαQ576R和IL-4Rα175V多态性位点的基因型。结果：IL-4RαQ576R位点，与正常对照相比，AA基因型频率在过敏病人特别是皮试阳性的过敏病人中显著升高（P〈0．05），在特异性IgE阳性的过敏病人中显著升高（P〈0．05），在主、次要抗原决定簇抗体阳性的过敏病人中均显著升高（P〈0．05），在APO抗体阳性过敏病人中显著升高（p=0．05）。

CD25在胃癌和邻近组织中的表达及对胃癌手术患者预后的影响

目的探讨胃癌、胃癌旁、胃正常组织CD25的表达,探索能预测胃癌手术预后的分子特征及分子标记物。方法研究2010年1月-2011年6月在解放军总医院第一医学中心行手术治疗的Ⅰ～Ⅲ期胃癌病例41例,收集术后癌、癌旁、正常组织标本,以免疫组化Envision二步法检测CD25蛋白水平的表达,随访至2015年6月30日,对影响无病生存期的因素进行单因素及多因素分析。结果 CD25在胃癌组织、胃癌旁组织、胃正常组织阳性表达率分别为80.49%、68.29%、80.49%;单因素分析显示CD25在胃癌组织阳性表达者无病生存期降低(16个月vs 48个月,P=0.013);多因素分析显示TNM分期(HR=11.268;95%CI=1.869～67.944)、肿瘤分化(HR=0.026;95%CI=0.002～0.334)、Lauren分型(HR=13.558;95%CI=1.231～149.294)、CD25胃癌组织(CD25C)阳性表达(HR=13.043;95%CI=3.107～54.758)为DFS的独立预后因素,TNM分期Ⅲ期、弥漫型胃癌、CD25C复发转移风险分别是Ⅰ～Ⅱ期、肠型胃癌、CD25胃癌组织阴性表达的11.268、13.558、13.043倍。结论 CD25在胃癌术后患者的胃癌组织、胃癌旁组织、胃正常组织均有阳性表达,CD25在胃癌组织高表达者复发转移风险高,预后不良。

大黄鱼IL-7Rα基因的克隆与表达分析

白细胞介素7受体α链(IL-7Rα,CD127)是一个重要的多效性细胞因子受体.本研究克隆得到大黄鱼(Larimichthys crocea)的IL-7Rα(LycIL-7Rα),其开放阅读框全长1 242 bp,编码413个氨基酸.通过氨基酸序列分析和多序列比对发现,LycIL-7Rα多肽具有I型细胞因子受体的典型特征,包括4个保守的半胱氨酸、1个信号肽、1个单次跨膜结构域、1个胞外的fibronectin type III(FN IIIlike)结构域、1个Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)基序以及胞内Box1结构域.系统进化分析表明,LycIL-7Rα与其他鱼类的IL-7Rα聚在一起,与鲈鱼(Lates calcarifer)IL-7Rα的亲缘关系最近.Realtime PCR结果表明,LycIL-7Rα在健康大黄鱼中为组成型表达,在脾脏中的表达量最高,在心脏中的表达量最低.大黄鱼经聚肌苷酸胞苷酸[Poly(I:C)]或溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激后,其脾脏中LycIL-7Rα的mRNA转录水平均显著上调.这些结果表明LycIL-7Rα可能在大黄鱼免疫反应中发挥重要作用.

松江鲈IL-15 Rα的结构特征与表达分析

白介素15受体α链(IL-15 Rα)是介导IL-15信号转导的高亲和力膜受体复合物的重要亚基。通过RACE技术克隆得到松江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel IL-15 Rα)基因cDNA全长序列(命名为TfIL-15Rα),TfIL-15Rα全长为998 bp,包括5′-非编码区(5′-UTR)85 bp,开放阅读框(ORF)663 bp和3′UTR 250 bp。基因ORF编码220个氨基酸(aa),前27 aa为信号肽序列。同源比对发现,松江鲈TfIL-15Rα与其他鱼类的序列一致性为19%~46%,保守度较低。多序列比对结果显示,IL-15Rα保守序列主要分布于sushi结构域(31~95 aa),4个高度保守的半胱氨酸形成的两对二硫键,是结构域发挥配体结合功能的重要位点。qRT-PCR分析表明,TfIL-15Rα广泛表达于松江鲈各组织中。腹腔注射LPS后,在皮肤、血液和肝脏中,刺激后2 h,IL-15Rα表达量迅速上调至最高峰,分别为对照组的14倍、52倍和21倍;而在脾脏中,刺激后12 h,TfIL-15RαmRNA达到最大表达量。由以上实验结果推测,TfIL-15Rα参与到了松江鲈抵抗外界刺激的先天免疫过程中。

弥漫大B细胞淋巴瘤患者外周血T淋巴细胞亚群变化及其临床意义

目的探讨弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者外周血中T淋巴细胞亚群的变化及其临床意义。方法回顾性分析2022年1月至2023年1月厦门大学附属第一医院收治的99例DLBCL患者临床资料。采用流式细胞术检测患者治疗前后外周血中T淋巴细胞亚群。根据患者采血检测时的疾病状态分为初诊DLBCL组(28例)及初治缓解后DLBCL组(71例),选取同期40名健康体检者作为健康对照组,比较3组间T淋巴细胞及相关亚群比例和绝对值的差异。分析初诊DLBCL患者T淋巴细胞各亚群间相关性,及各亚群与国际预后指数(IPI)评分、治疗反应的相关性。结果初诊DLBCL组CD3^(+)T细胞比例较健康对照组降低[(58±14)%比(67±7)%,P<0.05];初诊及初治缓解后DLBCL组CD3^(+)T细胞绝对值较健康对照组均降低[(875±483)/μl、(808±553)/μl比(1374±279)/μl,均P<0.001]。初诊DLBCL组CD4^(+)T及CD8^(+)T细胞绝对值较健康对照组均降低[(478±313)/μl比(695±154)/μl,(316±181)/μl比(525±193)/μl,均P<0.001];初治缓解后DLBCL组CD4^(+)T细胞比例及绝对值与初诊DLBCL组、健康对照组比较均降低[(40±14)%比(53±14)%、(51±9)%,(313±247)/μl比(478±313)/μl、(695±154)/μl,均P<0.05],CD8^(+)T细胞比例较另外两组均升高[(51±15)%比(37±12)%、(38±9)%,均P<0.001]。与健康对照组比较,初诊及初治缓解后DLBCL组调节性T细胞(Treg)和常规T细胞(Tcon)的效应、记忆亚群比例均升高[(79±16)%、(84±12)%比(71±11)%,(72±16)%、(76±14)%比(62±13)%,均P<0.05],CD127^(+)记忆Tcon和CD8^(+)T细胞亚群比例均降低[(73±14)%、(66±20)%比(85±8)%,(39±15)%、(25±21)%比(62±16)%,均P<0.05]。在初诊DLBCL组中,CD3^(+)T细胞和CD4^(+)T细胞的绝对值与效应Treg比例均呈负相关(r=-0.379,P=0.049;r=-0.384,P=0.040);IPI评分分组与CD8^(+)T细胞比例相关(Eta2=0.15,P=0.038);治疗后非完全缓解组较完全缓解组CD127^(+)记忆Tcon升高(P=0.020)。结论初诊DLBCL患者外周血T淋巴细胞比例及绝对值均降低,分化状态发生改变,且与患者临床特征及治疗反应相关。DLBCL治疗缓解后T淋巴细胞仍不能完全恢复至正常。

高表达FcεR1α和共表达NPY-EGFP的RBL细胞系构建及生物学功能检测

为构建一种高表达高亲和力IgE受体α链(high affinity IgE receptor alpha chain, FcεR1α)和共表达新型标志物神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的RBL-2H3细胞模型并鉴定其活性,设计FcεR1α-NPY-EGFP序列,构建表达载体pLV-Puro-FcεR1α-T2A-NPY-EGFP-TYK2,对其进行测序鉴定后无内毒素大量提取;经脂质体Lipo2000瞬时转染,于48 h后通过荧光定量PCR、Western blotting、FACS鉴定FcεR1α表达水平;通过传统β-氨基己糖苷酶介质释放试验检测受体的活性,通过NPY-EGFP释放试验检测新型指标的功能。经基因水平、蛋白质水平、膜蛋白表达及功能试验鉴定FcεR1α位于RBL-2H3细胞膜上并有结合人特异性IgE(specific IgE, sIgE)的活性,新型标志物NPY-EGFP可以受刺激分泌。该研究成功构建了一种高表达FcεR1α和共表达新型标志物NPY-EGFP的细胞模型用于检测人血清sIgE。